The DNA sequences diversity of Fusarium oxysporum

Abstract

中文摘要 II 英文摘要 III 致謝 V 壹、 前人研究 2 一、 鐮孢菌介紹 2 二、 生理發育 3 三、 分類依據 4 四、 特異性核酸序列介紹 4 五、 生物資訊 5 六、 生物晶片 6 七、 研究方向 7 貳、 材料與方法 8 一、 材料 8 (一)、菌株來源、培養及保存 8 二、 真菌DNA萃取 8 三、 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 9 四、 PCR產物之純化 9 五、 PCR產物與質體之接合作用 9 六、 核酸轉型作用 10 七、 DNA定序與引子組設計 10 八、 生物資訊分析 11 參、 結果與討論 12 一、 鑑定相關性基因之分析 12 二、 β-Tubulin (BT2) 基因序列之相似度分析 12 三、 Elongation Factor ( EF )基因序列之相似度分析 13 四、 Fusarium Osmotin Resistance ( FOR3 ) 基因序列之相似度分析 13 五、 Internal Transcribed Spacer ( ITS ) 核酸序列之相似度分析 14 六、 生物晶片之設計 15 八、 引子組設計 16 肆、 文獻 18 圖表 23 表一、 NCBI資料庫中不同鐮孢菌菌株之ITS序列及其相關資料。 24 表二、NCBI資料庫中不同鐮孢菌菌株之EF序列及其相關資料。 25 表三、NCBI資料庫中不同鐮孢菌菌株之BT2序列及其相關資料。 26 表四、寡核苷酸生物晶片之設計。 27 表五A、BT2測試點對不同分宿主離株之雜合反應型。 29 表五B、EF測試點對不同宿主分離株之雜合反應型。 30 表五C、FOR測試點對不同宿主分離株之雜合反應型。 31 表五D、ITS測試點對不同宿主分離株之雜合反應型。 32 圖一、作物所分離Fusarium菌株的BT2核酸序列之相似度分析。 34 圖二、作物所分離Fusarium菌株的EF核酸序列之相似度分析。 35 圖三、不同來源之Fusarium染色體DNA以 FOR3-F及FOR3-R引子組所進行之PCR增幅。 36 圖四、不同來源Fusarium之FOR3基因序列以多序列比對軟體所進行之相似度分析。 37 圖五、作物所分離Fusarium菌株的ITS核酸序列之相似度分析。 38 圖六A、FOR基因之多序列比對及測試點所在位置。 39 圖六B、FOR基因之多序列比對及測試點所在位置。 40 圖七、EF基因之多序列比對及測試點所在位置。 41 圖八A、ITS基因之多序列比對及測試點所在位置。 42 圖八B、ITS基因之多序列比對及測試點所在位置。 43 圖八C、ITS基因之多序列比對及測試點所在位置。 44 圖九、BT2基因之多序列比對及測試點所在位置。 45 圖十、不同來源鐮孢菌JN995193-EF-30核酸序列之多序列比對及引子設計位置。 46 附錄 47 附錄二 49[[abstract]]鐮孢菌 (Fusarium oxysporum) 為台灣地區田間常見的病原真菌，造成多種農作物包括香蕉、西瓜、香瓜等高經濟作物之病害，為台灣重要病害之一。本病原菌在早期多以顯微鏡下觀察型態來進行分類，近年使用Polymerase chain reaction 、Restriction fragment length polymorphism、Amplified fragment length polymorphism等方法來進行分類。由於Fusarium oxysporum的宿主廣泛，對不同宿主產生分化型(Formae Special)，由於分化型日益增加，因此在分類工作需要有更多的資料來判斷分化型的差異所在。本研究利用核酸序列比對方法去分析不同來源之Internal Transcribed Spacer (ITS)、Intergenic Spacer (IGS)、Elongation Factor(EF)、Fusarium Osmotin Resistance (FOR)等之相似度分析，可了解不同分化型菌株核酸序列間之差異。研究成果顯示FOR3核酸序列及比對後相似度較高之序列資料的結果可區分成8個Divisions，定序後之序列以BLAST搜尋NCBI資料庫發現此序列與Nectria及Gibberella的相似度較高其中FDS與Nectria其相似度86% ；Fo. Tomato和Fo. Cucumber與Gibberella相似度80%。以NCBI搜尋作物的Fusarium oxysporum f. sp.的不同來源之宿主分離株統整後進行相似度分析，分別建立ITS、EF及BT2的小型資料庫，經多序列比對後可發現ITS資料庫可分為3個Divisions。EF資料庫可分為2個Divisions。BT2資料庫可分為2個Divisions。ITS、EF及BT2核酸序列對不同宿主之分離株不具差異性，但多序列比對仍有顯示特異性序列，將有差異性之序列開發生物晶片之測試點，希望可依測試點所預測之特定反應型以區分宿主間的差異。 Fusarium oxysporum is a common pathogenic fungus in the fields of Taiwan. It causes serious diseases on plants including crops such as bananas, watermelons, melons and other economic crops, and it is one of the serious plant diseases in Taiwan. In the early stage, Fusarium was identified by the patterns under microscope. In recent years, the identify method often used is Polymerase chain reaction, Restriction fragment length polymorphism and Amplified fragment length polymorphism, etc. Because of the wide range of hosts, different Formae Special of Fusarium oxysporum are very much which is specific to their hosts and the association interaction between Fusarium oxysporum f.sp toxicity and hosts will be established. Since the increasing number of Formae Special, it is more and more difficult in identifying the Fusarium oxysporum. In this study, we utilized bioinformatics to analysis the similarity of nucleic acid sequence including Internal Transcribed Spacer (ITS), Intergenic Spacer (IGS), Elongation Factor (EF) and Fusarium Osmotin Resistance (FOR), etc. It can help us to find out the difference between different strains. The result shows FOR3 nucleic acid sequence and similarity higher, and the sequence data results can be divided into eight divisions, after sequencing and comparing to NCBI database found this sequence are similar with Nectria and Gibberella. The FDS and Nectria of similarity is 86%; the Fo. Tomato, Fo. Cucumber and Gibberella of similarity is 80%. By searching Fusarium oxysporum f. sp.'s crop from different host on NCBI and integrating similarity analysis, we established small databases for ITS, EF and BT2. The multiple sequence alignment results can be obtained from ITS database and can be divided into three divisions; EF database can be divided into two divisions; BT2 database can be divided into two divisions. ITS, EF and BT2 nucleic acid sequences of different host does not have any diversity, but still have specific sequence, these specific sequence will be designed to development the bio-chip test points, hope distinguish the diversity between the host by these test point