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LANA, U. G. de P.

MAGALHAES, J. V. de

PARENTONI, S. N.

TINOCO, C. F. da S.

Repository Open Access to Scientific Information from Embrapa

XXVIII Congresso Nacional de Milho e Sorgo, 2010, Goiânia: Associação Brasileira de Milho e Sorgo. CD-Rom 90 Obtenção de linhagens isogênicas para QTLs de tolerância ao alumínio em milho utilizando retrocruzamento assistido por marcadores  Carlos F. S. Tinoco1, Jurandir V. Magalhães2, Ubiraci G. P. Lana3, Sílvia N. J. Belicuas2, Sidney N. Parentoni2, Lauro J. M. Guimarães2 e Claudia T. Guimarães2  1 Bolsista da Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG – Caixa Postal 151, carlosfasane@yahoo.com.br, 2 Pesquisadores da Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG – Caixa Postal 151, 3 Analista da Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG – Caixa Postal 151  Palavras-chave: Zea mays L., tolerância ao Al, retrocruzamento assistido, marcadores SSR.   Introdução  O milho (Zea mays L.) é um cereal de grande importância econômica e social, sendo cultivado em praticamente todas as regiões agrícolas do mundo para a alimentação humana, animal e, mais recentemente, como fonte de biocombustível. Nos últimos anos, a produção desta cultura no Brasil vem experimentando aumentos expressivos, tendo esse setor um impacto significativo na sustentabilidade nacional. Atualmente, o país é o terceiro maior produtor de milho do mundo, sendo superado pelos Estados Unidos e pela China (GARCIA et al., 2006). Entretanto, a produtividade média brasileira, ainda é considerada baixa se comparada à de outros países produtores. Dentre os fatores que contribuem para a baixa produtividade, destaca-se a toxidez causada pelo alumínio (Al), intrínseca aos solos ácidos predominantes nas regiões agrícolas tropicais (FAO, 2007). Estes solos compreendem aproximadamente 48% da área agricultável em todo mundo (UEXKULL; MUTERT, 1995).  Uma vez sob condições de baixo pH, o Al assume a forma do íon Al3+, passando a ser solúvel e extremamente tóxico às plantas (KOCHIAN; JONES, 1997). A toxidez de Al provoca uma rápida inibição do crescimento radicular, acarretando maior susceptibilidade das plantas à seca e a deficiências minerais, resultando em baixa produtividade agrícola (KOCHIAN, 1995).  Genótipos tolerantes ao Al têm sido identificados em diferentes espécies vegetais, porém, os mecanismos fisiológicos e dos fatores genéticos responsáveis pela tolerância ao alumínio precisam ser melhor compreendidos. A tolerância ao Al em milho apresenta herança quantitativa sob controle de um número reduzido de genes (MAGNAVACA et al., 1987; LIMA et al., 1995). Concordando com tais resultados, Ninamango-Cárdenas et al. (2003) mapearam cinco QTLs de tolerância ao Al, sendo que apenas aquele localizado no bin 6.00 foi coincidente com os estudos de Sibov et al. (1999). Recentemente, Maron et al. (2010) identificaram dois genes candidatos, ZmMATE1 e ZmMATE2, que colocalizaram com dois QTLs de maior efeito na população de RILs derivada do cruzamento entre Cateto Al237 e L53 (Guimarães et al., dados não publicados).  Tais genes candidatos requerem estudos mais avançados, necessitando de estoques genéticos apropriados como linhagens isogênicas. As linhagens isogênicas apresentam vantagens nos estudos genético-moleculares e fisiológicos, uma vez que apresentam background genético homogêneo, variando apenas na região de interesse. No entanto, o tempo gasto para o seu desenvolvimento é a principal limitação para a ampla utilização desses genótipos. O método do retrocruzamento é o mais utilizado quando se tem por objetivo a XXVIII Congresso Nacional de Milho e Sorgo, 2010, Goiânia: Associação Brasileira de Milho e Sorgo. CD-Rom 91 introgressão de uma característica, com a subsequente recuperação do genoma recorrente, sendo geralmente  utilizado para corrigir genótipos-elites em características governadas por um ou poucos genes. O advento dos marcadores moleculares possibilitou a sua utilização para acelerar os programas de melhoramento, com base na seleção assistida. Considerando um programa de retrocruzamento assistido, a seleção pode ser para acompanhar a introgressão dos alelos favoráveis e para acelerar a recuperação do genoma recorrente (RIBAUT et al., 2002; DREHER et al., 2003), tendo sido utilizado também para geração de linhagens semi-isogênicas ou NILs (Near Isogenic Lines) (STUBER et al., 1999).  Assim, o objetivo deste trabalho foi utilizar a estratégia de retrocruzamento assistido no desenvolvimento de linhagens semi-isogênicas para dois QTLs de efeito maior associados com a tolerância ao Al em milho, onde foram previamente colocalizados dois genes candidatos ZmMATE1 e ZmMATE2.   Material e Métodos Seleção das Linhagens Doadoras Em um estudo anterior, o mapeamento de QTL foi realizado em uma população de 118 RILs derivadas do cruzamento entre duas linhagens contrastantes Cateto Al237 e L53, tolerante e sensível ao alumínio, respectivamente. A população foi avaliada em solução nutritiva contendo 39 µM de alumínio e o mapa foi construído com 154 marcadores SSR, RFLP e STS. Dois QTLs de efeito maior foram identificados nos cromossomos 5 e 6 (indicados pelas setas na Figura 1), explicando em torno de 16% da variância fenotípica. Dentre as linhagens recombinantes, foram selecionadas duas delas, a RIL-150 e a RIL-84, apresentando apenas um dos QTLs de interesse cada, além de possuírem mais de 50% do genoma da L53 (Figura 1).  lg1_1NP667103a 0.00bnlg1179 23.00umc1071 32.70umc1269 33.90umc2224 44.30bcd1230a 54.10bnlg109 63.30magi49968 71.20umc1073 73.10bnlg1083 74.40bnlg176 75.40phi10927 78.20bnlg1811 90.40bnlg1884 106.30umc1076 114.10umc1395 116.00umc1590 128.30lg1_2bnlg615 0.00phi039 14.30phi037 15.20dupssr12 23.60mmc0041 25.10phi055 43.40phi308707 64.90bnlg131 83.10bnlg504 88.00phi064 97.70umc1862 119.20mmc0011 127.70umc1208 148.30magi448924 153.90lg2dupssr27 0.00bnlg381 10.70umc2032 21.10umc1003 33.70bnlg371 41.10umc1028 52.40nc003 77.30umc1285 100.90umc1042 135.80umc1536 139.10umc2374 144.40mmc0191 148.60bnlg1045 149.60bnlg198 153.40dupssr24 158.80umc1230 172.00lg3umc1394 0.00umc1970 8.70bnlg1325 30.20bnlg1523 36.70bnlg1447 49.10umc1030 66.20phi374118 71.30bnlg2136 72.70mmc0312 81.20magi154934 89.40phi053 93.70isu68 114.40bnlg2241 118.70dupssr23 121.60bnlg1449 124.60bnlg1063 136.70bnlg197 162.80dupssr17 163.70umc1690 166.70umc1659 169.30umc1148 176.10mmc251 189.20bnlg1536 210.90bnlg1496 217.60lg4umc1088 0.00phi026 6.50nc005 9.80umc1031 18.60bnlg1621 31.90bnlg2291 53.70dupssr34 63.10umc1101 99.10bnlg589 103.80umc1532 108.70umc1503 114.20lg5phi113 0.00bnlg105 6.80ZmMATE2 19.80umc1056 25.40umc1935 31.20bnlg2323 54.20umc1221 67.50umc1822 81.10umc1019 105.20umc1680 111.80magi3920 116.80magi4614 129.50phi048 133.00umc1537 141.00lg6_1phi126 0.00bnlg161 2.40bnlg238 3.30NP667103 9.20ZmMATE1 11.60umc1018 24.50phi15981 48.70phi077 66.20bnlg1422 74.00umc1083 82.70lg6_2umc1413 0.00mmc0241 22.90phi078 29.50nc012 36.00phi025 37.80umc1805 44.70nc013 45.10bnlg345 55.50umc1859 59.70umc1520 86.70lg7bnlg2132 0.00umc1066 29.70umc1409 37.20bnlg1094 48.80umc1015 74.10magi30642 99.70umc1029 125.30lg8magi41318 0.00umc2146 2.50bnlg2046 15.40bnlg1176 17.20bnlg666 20.90bnlg162 21.70bnlg1607 38.70bnlg1031 42.80umc2014 47.80bnlg1828 63.30umc1005 72.90dupssr14 85.30phi080 101.90lg9phi028 0.00umc1033 19.90magi441238 27.50umc1691 31.20umc1771 40.10umc1366 61.70bcd1230b 88.80lg10umc2018 0.00phi054 24.90bnlg210 34.80umc2180 44.80umc1506 57.90magi4160591 69.00bnlg1677 86.40umc1084 89.50umc1038 115.70 A: RIL-150  XXVIII Congresso Nacional de Milho e Sorgo, 2010, Goiânia: Associação Brasileira de Milho e Sorgo. CD-Rom 92 lg1_1NP667103a 0.00bnlg1179 23.00umc1071 32.70umc1269 33.90umc2224 44.30bcd1230a 54.10bnlg109 63.30magi49968 71.20umc1073 73.10bnlg1083 74.40bnlg176 75.40phi10927 78.20bnlg1811 90.40bnlg1884 106.30umc1076 114.10umc1395 116.00umc1590 128.30lg1_2bnlg615 0.00phi039 14.30phi037 15.20dupssr12 23.60mmc0041 25.10phi055 43.40phi308707 64.90bnlg131 83.10bnlg504 88.00phi064 97.70umc1862 119.20mmc0011 127.70umc1208 148.30magi448924 153.90lg2dupssr27 0.00bnlg381 10.70umc2032 21.10umc1003 33.70bnlg371 41.10umc1028 52.40nc003 77.30umc1285 100.90umc1042 135.80umc1536 139.10umc2374 144.40mmc0191 148.60bnlg1045 149.60bnlg198 153.40dupssr24 158.80umc1230 172.00lg3umc1394 0.00umc1970 8.70bnlg1325 30.20bnlg1523 36.70bnlg1447 49.10umc1030 66.20phi374118 71.30bnlg2136 72.70mmc0312 81.20magi154934 89.40phi053 93.70isu68 114.40bnlg2241 118.70dupssr23 121.60bnlg1449 124.60bnlg1063 136.70bnlg197 162.80dupssr17 163.70umc1690 166.70umc1659 169.30umc1148 176.10mmc251 189.20bnlg1536 210.90bnlg1496 217.60lg4umc1088 0.00phi026 6.50nc005 9.80umc1031 18.60bnlg1621 31.90bnlg2291 53.70dupssr34 63.10umc1101 99.10bnlg589 103.80umc1532 108.70umc1503 114.20lg5phi113 0.00bnlg105 6.80ZmMATE2 19.80umc1056 25.40umc1935 31.20bnlg2323 54.20umc1221 67.50umc1822 81.10umc1019 105.20umc1680 111.80magi3920 116.80magi4614 129.50phi048 133.00umc1537 141.00lg6_1phi126 0.00bnlg161 2.40bnlg238 3.30NP667103 9.20ZmMATE1 11.60umc1018 24.50phi15981 48.70phi077 66.20bnlg1422 74.00umc1083 82.70lg6_2umc1413 0.00mmc0241 22.90phi078 29.50nc012 36.00phi025 37.80umc1805 44.70nc013 45.10bnlg345 55.50umc1859 59.70umc1520 86.70lg7bnlg2132 0.00umc1066 29.70umc1409 37.20bnlg1094 48.80umc1015 74.10magi30642 99.70umc1029 125.30lg8magi41318 0.00umc2146 2.50bnlg2046 15.40bnlg1176 17.20bnlg666 20.90bnlg162 21.70bnlg1607 38.70bnlg1031 42.80umc2014 47.80bnlg1828 63.30umc1005 72.90dupssr14 85.30phi080 101.90lg9phi028 0.00umc1033 19.90magi441238 27.50umc1691 31.20umc1771 40.10umc1366 61.70bcd1230b 88.80lg10umc2018 0.00phi054 24.90bnlg210 34.80umc2180 44.80umc1506 57.90magi4160591 69.00bnlg1677 86.40umc1084 89.50umc1038 115.70  Figura 1: Genótipo gráfico das linhagens recombinantes RIL-150 e RIL-84 contendo os QTLs dos cromossomos 5 e 6, respectivamente.  Retrocruzamento Assistido Cada uma das RILs foi cruzada com a linhagem L53, que foi utilizada como parental recorrente. A região de cada QTL de tolerância ao alumínio compreende um gene candidato, mapeado com marcadores derivados de sequências genômicas e um par de marcadores SSR flanqueadores.  Progênies de cada RC1 foram genotipadas, sendo selecionados os indivíduos heterozigotos para os genes candidatos e homozigotos para o genitor recorrente considerando os marcadores SSRs flanqueando os QTLs. As plantas selecionadas para os QTLs foram retrocruzadas com a linhagem L53 e os indivíduos RC2 foram novamente genotipados para os genes alvos e para marcadores distribuídos ao longo do genoma, a fim de aumentar a recuperação do genoma recorrente. Indivíduos com a maior recuperação do genoma recorrente foram autofecundados para a obtenção dos alelos dos genes candidatos em homozigose. Adicionalmente, indivíduos RC1 apresentando os locos de interesse foram cruzados entre si para a piramidação deles, utilizando os mesmos critérios de seleção genotípica.   Genotipagem com Marcadores Moleculares  A genotipagem foi realizada utilizando DNA genômico isolado de folhas jovens das plantas oriundas dos respectivos retrocruzamentos, seguindo o protocolo descrito por Saghai-Maroof et al. (1984), com algumas modificações.  As reações de amplificação utilizando iniciadores não marcados foram realizadas segundo descrito por Ninamango-Cárdenas et al. (2003). Os produtos de amplificação foram separados em géis de agarose 1,5% (m/v) corados com brometo de etídeo (Figura 2A) ou de poliacrilamida 10% (m/v) corado com AgNO3 (Figura 2B). Já os produtos de amplificação utilizando iniciadores fluorescentes, marcados com as fluorescências NED, FAM ou HEX, foram gerados e analisados de acordo com Padilha (2002) no sequenciador automático de DNA ABI Prism 377 (Applied Biosystems®) (Figura 2C).    B: RIL-84  Cateto Al237 - Tolerante L53 - Sensível   XXVIII Congresso Nacional de Milho e Sorgo, 2010, Goiânia: Associação Brasileira de Milho e Sorgo. CD-Rom 93         Figura 2. A - Padrão de amplificação do gene candidato ZmMATE1 analisado em gel de agarose 1,5% (m/v). B - Padrão de amplificação do marcador SSR umc1018 visualizado em gel de poliacrilamida 10% (m/v). C - Padrão de amplificação do gene candidato ZmMATE2 marcado com a fluorescência 6-FAM e avaliado no sequenciador automático ABI Prism 377. P1 - Linhagem doadora (Cateto Al237), P2 - Linhagem recorrente (L53), A - Alelo derivado da linhagem doadora, B - Alelo da linhagem recorrente e H – Heterozigoto.    Para a análise dos indivíduos da geração RC2 foram avaliados 19 primers, previamente identificados como polimórficos entre as RILs e a L53. Os primers em heterozigose nos indivíduos RC2 foram reavaliados nas suas progênies RC3. Os dados moleculares foram codificados como A (alelo do genitor doador) e H (heterozigoto).   Resultados e Discussão  No primeiro ciclo de retrocruzamento foi realizada a seleção assistida por marcadores apenas para a região dos dois QTLs de efeito maior. Para a RIL-150 foram selecionados o gene candidato ZmMATE2 e os marcadores SSR phi113 e bnlg105, localizados no cromossomo 5 (Figura 3A) e para a RIL-84 foram selecionados o gene candidato ZmMATE1 e o marcador umc1018, localizados no cromossomo 6 (Figura 3B).  P1 P2  A   H  H   A   A   A   H    H   H   H   H   H   H    B   B   A    B   A    H   H   A    B   A    B   A   A Indivíduos RC2-F2 150 A P1     P2       A        H        H        A       A        A        B        A        A        H       B        H        B    C M  P1  P2     H     H     H      H     H     B    A    A      B      H    H     A      B     H     H    A           C B Indivíduos RC2-F2 84 Indivíduos RC2-F2 84 XXVIII Congresso Nacional de Milho e Sorgo, 2010, Goiânia: Associação Brasileira de Milho e Sorgo. CD-Rom 94                    Figura 3. Região dos QTLs de efeito maior nos cromossomos 5 (A) e 6 (B) antes e após um ciclo de retrocruzamento assistido por marcadores indicando a conversão das regiões genômicas flanqueando os respectivos genes candidatos ZmMATE2 e ZmMATE1.  No segundo ciclo de retrocruzamento, dos 19 primers SSR avaliados, foram selecionados os indivíduos que possuíam pelo menos 17 deles em homozigose, indicando uma recuperação em torno de 89% do genoma recorrente. Considerando que cada uma das RILs originalmente apresentava em torno de 50% do genoma recorrente, os indivíduos do RC2-F2 obtidos após a seleção assistida podem ser considerados como possuindo pelo menos 96,9% do genoma recorrente, que equivale ao quarto ciclo de retrocruzamento. O uso da SAM acelerou a obtenção das linhagens isogênicas para dois QTLs de efeito maior associados com a tolerância ao Al em milho, que serão fundamentais para a validação dos efeitos dos QTLs e para estudos moleculares avançados.  Agradecimentos O projeto contou com recursos da Fundação McKnight - CCRP, Generation Challenge Programme, FAPEMIG e Embrapa Milho e Sorgo.   Referências DREHER, K.; KHAIRALLAH, M.; RIBAUT, J. M.; MORRIS, M. 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Obtenção de linhagens isogênicas para QTLs de tolerância ao alumínio em milho utilizando retrocruzamento assistido por marcadores.

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