Universidad de Málaga, Servicio de Publicaciones y Divulgación Científica
Abstract
La fresa (Fragaria xananassa) es un fruto altamente consumido y apreciado por su delicado sabor, aroma y valor nutritivo (Tulipani et al., 2008; Giampieri et al., 2012). El cultivo de fresa se ha extendido por todo el mundo ocupando en la actualidad una superficie de 254.000 hectáreas y una producción aproximada de 4 millones de toneladas con una distribución global del 42.8%, 29.2%, 18.4%, 8.8% and 0.8% en América, Europa, Asia, África y Oceanía, respectivamente (FAOSTAT, 2012; http://faostat3.fao.org). España ocupa el primer lugar mundial dentro de los exportadores de fresas y el cuarto en relación a producción (FAOSTAT, 2012), siendo la provincia de Huelva, comunidad autónoma de Andalucía, el principal productor, en donde se concentra aproximadamente el 95% de la producción nacional. España ocupa un puesto privilegiado no sólo en producción sino también en exportación y desarrollo de programas de mejora de variedades, lo que genera retornos importantes tanto en la comercialización de fruta en fresco como los generados por "royalties". En los últimos años, los programas de mejora se han centrado en caracteres tales como productividad y morfología, entre los que destacan el tamaño de fruto, la dureza y el color. Sin embargo, en la actualidad el consumidor está demandando frutos con mayor valor en compuestos saludables (conocidos como nutracéuticos) debido a los efectos beneficiosos de éstos en la salud, lo que influye en toda la cadena de distribución y producción. Este hecho ha producido un giro en la selección de nuevas variedades buscando, además de los aspectos agronómicos, una mejora en la calidad organoléptica y nutricional. Estos esfuerzos buscan, entre otras cosas, un incremento en la sostenibilidad y competitividad de este cultivo en España, que le permita seguir liderando las exportaciones y e incrementando su producción.
En este escenario, nuestro grupo lleva varios años liderando proyectos de investigación basados tanto en la identificación de genes implicados en la regulación del desarrollo y maduración del fruto de fresa como en la caracterización de herramientas biotecnológicas dirigidas a la mejora de dichos frutos. Uno de los principales intereses del grupo y objetivo de esta tesis doctoral, es el estudio y determinación de la función biológica de los alérgenos Fra de fresa (Fragaria xananassa), que se sabe están involucrados en el control de la ruta de biosíntesis de flavonoides (Muñoz et al., 2010). Los flavonoides son compuestos que, además de ser responsables del color y aroma del fruto de fresa (Fait et al., 2008; Muñoz et al., 2011), son actualmente de gran interés biotecnológico debido a las propiedades nutricionales, farmacéuticas y medicinales que presentan para el consumo humano (Hichri et al., 2011; Giampieri et al., 2013). La identificación de estos alérgenos fue resultado de los estudios de Emanuelsson y colaboradores que, motivados por la observación de que ciertas variedades blancas de fresa eran bien toleradas por individuos que presentaban reacciones alérgicas a variedades rojas, realizaron un estudio proteómico de variedades comerciales de ambos tipos de frutos (Karlsson et al., 2004; Hjerno et al., 2006). Finalmente, pusieron de manifiesto que las variedades blancas de fresa presentaban un contenido en la proteína FaFra1, potencial alérgeno de fresa, significativamente inferior al de las variedades rojas. Posteriormente, en nuestro laboratorio se identificaron dos genes codificantes de nuevas isoformas del alérgeno Fra (FaFra2 y FaFra3) y se estableció una relación entre la expresión de dichos genes y la ruta de biosíntesis de flavonoides que sugería un papel regulador de las proteínas FaFra en esta ruta biosintética (Muñoz et al., 2010).
Las proteínas Fra de fresa pertenecen a la familia de proteínas PR-10 ("pathogenesis-related 10 proteins"), denominadas de esta forma por su relación con la respuesta de las plantas frente a patógenos (Markovic-Housley et al., 2003). A su vez, las proteínas Fra, también forman parte de la superfamilia de proteínas Bet v 1, cuyo principal representante es el alérgeno del polen de abedul (que da nombre al grupo), y que engloba una variedad de alérgenos, no sólo de polen, sino también de frutas y alimentos (Markovic-Housley et al., 2003; Fernandes et al., 2013). Sin embargo, aunque las propiedades alergénicas de este tipo de proteínas han sido ampliamente estudiadas, sus funciones y mecanismos de actuación en las plantas que las producen permanecen prácticamente desconocidos (Mogensen et al., 2007). Para investigar la función biológica desempeñada por los alérgenos FaFra en el fruto de fresa y poder establecer el papel que estas proteínas juegan en la regulación de la biosíntesis de flavonoides y, finalmente, obtener información sobre la funcion de las proteínas de tipo PR-10 ampliamente distribuidas en el reino vegetal, en este trabajo se abordaron los siguientes objetivos:
I. Caracterización de la familia multigénica Fra de fresa (Fragaria xananassa), para profundizar en el estudio de su efecto en el control de la ruta de biosíntesis de flavonoides.
II. Búsqueda de potenciales ligandos naturales de las proteínas FaFra mediante el empleo de técnicas bioquímicas y biofísicas.
III. Análisis estructural de las proteínas FaFra para obtener detalles sobre su mecanismo de actuación a nivel molecular.
INTRODUCCIÓN
La Fresa
La fresa pertenece a la familia Rosaceae y al género Fragaria. En Fragaria, existen cuatro grupos básicos de fertilidad que se asocian principalmente con el número de ploidía o número de cromosomas. La especie silvestre más común, F. vesca L., presenta 14 cromosomas, es diploide y sirve de modelo experimental para el género (Shulaev et al., 2011). La fresa cultivada es, sin embargo, una especie octoploide de 56 cromosomas que procede del cruce de las especies F. chiloensis y F. virginiana, ambas especies octoploides (Rousseau-Gueutin et al., 2009). Uno de los cultivares más ampliamente extendido en todo el mundo es “Camarosa”, ideal para inviernos suaves, como es el caso de Huelva en España. Siendo esta la variedad donde hemos realizado mayoritariamente nuestras investigaciones.
De forma general, los frutos pueden clasificarse como climatéricos o no-climatéricos en función del patrón de respiración y la producción de etileno que tienen lugar a lo largo del proceso de maduración (Grierson, 2013). El fruto de fresa sirve como modelo para el estudio de los frutos no-climatéricos; en estos, no se observa un aumento drástico en la tasa de respiración durante la maduración ni tampoco una elevada producción de etileno (Iannetta et al., 2006). La fresa es, además, un fruto muy particular ya que, a diferencia de otros frutos botánicamente definidos como resultado de la expansión del ovario, la fresa es en realidad un receptáculo floral engrosado, compuesto de una médula central o corazón, un receptáculo carnoso, la epidermis y un conjunto de haces vasculares que conectan los aquenios, que son los verdaderos frutos de la fresa. Los aquenios, que son una combinación de tejido del ovario y de la semilla y se originan en la base de cada pistilo, se disponen de forma helicoidal en la superficie del fruto y se encuentran insertados en la capa epidérmica del receptáculo (Perkins-Veazie, 1995).
Todo esto hace que el estudio del fruto de fresa sea especialmente interesante tanto desde el punto de vista genético como fisiológico.
Composición Fenólica del Fruto de Fresa
La fresa se caracteriza por ser un fruto con un alto contenido en metabolitos secundarios, muchos de ellos considerados como compuestos “bioactivos”, ya que se ha demostrado que presentan efectos beneficiosos para la salud humana (Diamanti et al., 2012; Giampieri et al., 2013). En particular, las fresas son ricas en minerales, vitamina C, folato y compuestos fenólicos. Los compuestos fenólicos no sólo poseen propiedades antioxidantes y anti-carcinogénicas (Scalzo et al., 2005, Tulipani et al., 2008; Giampieri et al., 2013) sino que además, juegan un papel esencial en la biología del fruto, puesto que no sólo son los principales responsables del color y sabor de la fresa, sino que también desempeñan funciones tan importantes como la defensa frente a patógenos y a condiciones ambientales adversas, como puede ser la exposición a la radiación ultravioleta (Aaby et al., 2005, 2007).
Los compuestos fenólicos se sintetizan a partir de L-fenilalanina a través de las rutas de biosíntesis de fenilpropanoides y flavonoides (Tohge et al., 2013). Entre la gran variedad de compuestos fenólicos presentes en la fresa, los mayoritarios son los flavonoides. La síntesis de estos compuestos tiene lugar en dos fases durante el desarrollo del fruto de fresa, lo cual está íntimamente relacionado con la función que cada uno de estos metabolitos desempeña a lo largo de la maduración (Halbwirth et al., 2006; Aaby et al., 2007; Fait et al., 2008). Durante las primeras etapas del desarrollo del fruto, los flavonoides principalmente acumulados en la fresa son de tipo flavan-3-ols y proantocianidinas; estos metabolitos, son responsables del sabor astringente de los frutos inmaduros. En las etapas más tardías del desarrollo, cuando el fruto comienza a madurar, se incrementa la síntesis de otros compuestos flavonoides, entre ellos, antocianinas y flavonoles, que contribuyen a la coloración de frutos y flores (Halbwirth et al., 2006, Fait et al., 2008). Las antocianinas son, cuantitativamente, los polifenoles más importantes en el fruto de fresa maduro y están principalmente representados por derivados glucosilados de pelargonidina y cianidina; estos metabolitos son los pigmentos que confieren a la fresa su color característico (Tulipani et al., 2008; Muñoz et al., 2011).
De este modo, la composición fenólica de la fresa no sólo afecta a su valor nutricional sino también a la calidad final del fruto, lo que actualmente se traduce en la existencia de muchas líneas de investigación enfocadas al estudio del desarrollo y maduración del fruto de fresa, incluyendo la síntesis de flavonoides, lo que hace que éste sea un ámbito científico muy relevante.
Proteínas PR-10
Las proteínas relacionadas con patogénesis PR ("Pathogenesis-Related proteins") están ampliamente distribuidas en el reino vegetal y se clasifican en 17 familias (PR1-PR17) en función de su estructura primaria y las propiedades biológicas y bioquímicas que presentan (van Loon et al., 2006; Sels et al., 2008; Fernandes et al., 2013). En un inicio, las proteínas PR se clasificaron en base a la respuesta que inducían frente a patógenos. Sin embargo, más tarde, este término se amplió y se incluyeron en esta familia aquellas proteínas no sólo relacionadas con la defensa a patógenos, sino también aquellas relacionadas con la respuesta a condiciones que mimetizaban el efecto frente a agentes patogénicos, como el estrés abiótico o el daño mecánico (Sels et al., 2008; Lebel et al., 2010). A pesar de que la familia de proteínas PR ha sido ampliamente estudiada, la función de la mayoría de ellas sigue siendo desconocida y, en particular, el papel biológico de las proteínas PR-10 no está bien definido.
Entre las proteínas de tipo PR-10 se encuentra un grupo de alérgenos que pertenece a la superfamilia de proteínas Bet v 1 (Markovic-Housley et al., 2003). Las proteínas Bet v 1 se caracterizan por presentar una estructura muy conservada que encierra una cavidad central que es capaz de unir ligandos hidrofóbicos (Mogensen et al., 2002; Markovic-Housley et al., 2003; Seutter von Loetzen et al., 2013). Actualmente en fresa se conocen tres miembros de la familia Bet v 1: FaFra1, FaFra2 y FaFra3 (Hjerno et al., 2006; Muñoz et al., 2010). Se sabe que las proteínas FaFra están relacionadas con la formación de compuestos coloreados en la fresa (Muñoz et al., 2010), lo que principalmente depende de la producción de ciertos flavonoides como el cianidin-3-O-glucósido y el pelargonidin-3-O-glucósido. Estudios previos desarrollados en nuestro laboratorio (Muñoz et al., 2010), permitieron establecer una relación directa entre las proteínas FaFra y la ruta de biosíntesis de flavonoides. El silenciamiento transitorio (mediado por RNAi) de los genes FaFra en frutos de fresa (cv. Elsanta), puso de manifiesto que el contenido de aquellos metabolitos responsables del color del fruto (cianidin-3-O-glucósido y pelargonidin-3-O-glucósido) se veía reducido en los frutos silenciados. Además de la acumulación de estos compuestos, también se vio afectada la de otros como el kaempferol-3-O-glucósido y el pelargonidin-3-malonil-glucósido que mostraron niveles reducidos en comparación a los frutos control. Sin embargo, no sólo se observó la disminución en la acumulación de estos compuestos sino que también otros metabolitos, como la catequina y ciertas proantocianidinas, aumentaron sus niveles en los frutos silenciados (Muñoz et al., 2010). De forma paralela, se observó que el silenciamiento de los genes FaFra tenía un efecto a nivel transcripcional sobre genes fundamentales de la ruta de biosíntesis de flavonoides, específicamente, fenilalanin-amonio-liasa (PAL) y chalcona sintasa (CHS) aparecían co-silenciados junto a los alérgenos FaFra (Muñoz et al., 2010). Estos resultados indicaban la posibilidad de un papel regulador de las proteínas FaFra en la ruta de biosíntesis de flavonoides. Sin embargo, se carece de información sobre el mecanismo molecular por el cual estas proteínas podrían estar ejerciendo su función.
La estructura conservada de las proteínas PR-10 y su habilidad para unir distintos tipos de ligandos en su cavidad hidrofóbica central indican que la función de la proteínas FaFra en la ruta de biosíntesis de flavonoides podría estar íntimamente relacionada con su unión a un compuesto flavonoide y que, cabría la posibilidad de que cada uno de los miembros de la familia pudiesen unir distintos intermediarios de la ruta. Debido a la presencia de cavidades conservadas en las proteínas PR-10 y su capacidad de unir ligandos, se han propuesto varias funciones para esta familia de proteínas y, en particular para las proteínas de la familia Bet v 1, se han planteado principalmente dos posibilidades: un posible papel como transportadores celulares de metabolitos y una posible función como componentes esenciales en cascadas de señalización (Mogensen et al., 2002; Liu y Ekramoddoullah, 2006; Radauer et al., 2006; Mogensen et al., 2007).
Mediante la caracterización de la familia multigénica FaFra y el estudio bioquímico, biofísico y estructural de las proteínas FaFra en presencia y ausencia de intermediarios de la ruta de biosíntesis de flavonoides, este trabajo tiene como objetivo principal aclarar el papel de las proteínas FaFra de fresa en la regulación de la ruta de biosíntesis de antocianos. Este trabajo debería también contribuir al el entendimiento general del la función biológica de las proteínas PR-10, que se encuentran ampliamente distribuidas en el reino vegetal.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
I. Caracterización de la Familia Multigénica Fra de Fragaria xananassa
Recientemente ha sido publicado el genoma de la especie Fragaria vesca (F. vesca) que sirve como modelo para el género Fragaria (Shulaev et al., 2011). Esto ha generado un conjunto de herramientas muy valiosas que, en nuestro caso, han sido muy útiles para profundizar en el estudio de la familia de genes Fra de Fragaria xananassa (FaFra). Por otro lado, los grandes avances alcanzados en los últimos años en el campo de la secuenciación masiva de RNA (RNA-Seq), han hecho que el RNA-Seq se haya convertido en un método muy efectivo para obtener grandes cantidades de datos transcriptómicos de muchos organismos y distintos tipos de tejidos y que, además, se considere como una potente herramienta para estimar tanto la abundancia de los genes expresados en una circunstancia determinada como su expresión diferencial en distintas condiciones de estudio (Grabherr et al., 2010; Trapnell et al., 2010).
En base a estos avances científicos y tecnológicos y para caracterizar la familia multigénica FaFra, se plantearon dos estrategias metodológicas principales, ambas basadas en la secuenciación masiva de RNA mensajero (RNA-Seq) extraído de plantas de fresa. La primera de ellas tenía como objetivos principales la identificación de las secuencias FaFra expresadas en fresa y la determinación de sus perfiles de expresión. Para ello, se recurrió a una experiencia de RNA-Seq que nuestro laboratorio ha desarrollado en plantas pertenecientes al cultivar Camarosa, no solo a lo largo de la maduración de los frutos de fresa en los estadios verde, blanco, viraje blanco-rojo y rojo (en aquenios y receptáculos por separado) sino también en tejidos vegetativos (hoja y raíz). El análisis de datos de RNA-Seq puede llevarse a cabo mediante dos metodologías principales: 1) Alineamiento de las lecturas a un genoma de referencia; 2) Ensamblado del transcriptoma de novo (Martin et al., 2013). Aunque el genoma de la especie F. vesca (diploide) sirve de modelo para el género Fragaria, y el genoma de la especie cultivada Fragaria xananassa (octoploide) presenta un alto grado de conservación con el de la especie salvaje (Bombarely et al., 2010), el hecho de que el genoma de F. vesca es aún incompleto y su anotación necesita mejoras, nos llevó a analizar los datos de RNA-Seq de nuestra experiencia de maduración y tejidos vegetativos de fresa utilizando un ensamblado del transcriptoma de novo, utilizando el método Trinity (Grabherr et al., 2010). El análisis del transcriptoma realizado por nuestro grupo, en colaboración con el Dr. José. F. Sánchez Sevilla del centro IFAPA de Churriana (Málaga), ha permitido obtener una ingente cantidad de datos de expresión de genes. El análisis de los datos de RNA-Seq ha resultado en la identificación de 10 genes putativos principales que conforman la familia Fra (Fragaria xananassa) y ha permitido establecer sus correspondientes homólogos en F. vesca. Los genes FaFra, se han nombrado de forma consecutiva desde FaFra1 a FaFra10 (Tabla 1, Figuras 4-8, Capítulo 1). Además, se han identificado variedades alélicas para muchos de ellos, en particular, FaFra1c1-c2, FaFra2b, FaFra4a1-a2 y FaFra4b1-b2, FaFra7a-b y FaFra9a1-a2. A su vez, las proteínas FaFra se han clasificado en cuatro grupos principales, de acuerdo a su nivel de homología con los alérgenos FaFra1, FaFra2 y FaFra3 previamente publicados (Muñoz et al., 2010); el cuarto grupo, sin embargo, engloba las secuencias FaFra8, FaFra9 y FaFra10 que conforman el conjunto más divergente de proteínas FaFra (Figuras 9 y 10, Capítulo 1). Adicionalmente, se ha obtenido información detallada sobre los niveles de expresión de los genes FaFra tanto en tejidos vegetativos de fresa como a lo largo de los estadios de maduración del fruto, siendo los niveles de mensajeros observados distintos para cada una de los genes identificados. De forma general, los transcritos más representados corresponden a los genes FaFra1c1, FaFra1c2, FaFra2b y FaFra4a1 (Tabla 2, Figura 11-12, Capítulo 1). El tejido donde la expresión de FaFra resultó ser más importante fue la raíz, seguido de receptáculo, donde los genes más representativos fueron FaFra1c1 y FaFra2b; estos genes, mostraron perfiles de expresión complementaria ya que, mientras que FaFra1c1 disminuía a lo largo de maduración, FaFra2b aumentaba su expresión (Figura 11d, Capítulo 1). Además, los niveles de expresión de estos genes, se corresponden con los niveles de proteína observados mediante Western-blot en los frutos de fresa (Figura 3, Capítulo 1).
La segunda experiencia de RNA-Seq, se diseñó con el fin de identificar aquellos genes que se expresaban de forma diferencial en receptáculos control y receptáculos donde se había silenciado de forma transitoria los genes FaFra inyectados con soluciones de Agrobacterium tumefaciens portadoras de construcciones RNAi del gen diana (Hoffmann et al., 2006; Muñoz et al., 2010). En este caso, el análisis de datos de RNA-Seq se llevó a cabo mapeando las lecturas obtenidas al genoma de referencia F. vesca utilizando los programas TopHat2 para el mapeado de secuencias (Kim et al., 2013) y Cufflinks para la cuantificación de lecturas y determinación de la expresión diferencial de genes entre los frutos control y los frutos Fra-RNAi silenciados (Trapnell et al., 2012). Como resultado, 4426 genes se vieron afectados, de los cuales 2528 resultaron sobre-expresados y 1898 reprimidos. Enfocando nuestra atención en la familia de genes Fra y en los genes involucrados en la biosíntesis de flavonoides, concluimos que el silenciamiento de FaFra2A (principal gen FaFra en receptáculo rojo) y FaFra6, afectaba a genes primordiales de la ruta de biosíntesis de flavonoides tales como fenilalanina-amonio liasa (PAL), chalcona sintasa (CHS), cinamato-4-hidroxilasa (C4H), 4-cumarato-CoA-ligasa (4CL), chalcona isomerasa (CHI), dihidroflavonol-reductasa (DFR), flavanona-3-hidroxilasa (F3H) y 3-O-glucosiltransferasa (3-GT), algunos de los cuales se verían sobre-expresados y otros silenciados, siendo los reprimidos los más importantes en cuanto a expresión en receptáculo. Asimismo, los factores de transcripción de tipo R2R3-Myb, FaMYB1 y FAMYB10, aparecieron co-silenciados junto a FaFra2A y FaFra6. Nuestros resultados, de este modo, confirman el papel esencial regulador que ejercen los genes FaFra en la ruta de biosíntesis de flavonoides.
Finalmente, para obtener información sobre la localización subcelular de las proteínas FaFra, se llevaron a cabo ensayos de microscopía confocal en plantas de Nicotiana benthamiana (expresión transitoria) y de Arabidopsis thaliana (generación de líneas transgénicas) expresando proteínas FaFra a fusionadas a la proteína GFP (Fra-GFP). Los ensayos de localización subcelular de las prote
