No presente trabalho são determinados os biofenóis em azeites ‘Galega’
e ‘Azeiteira’ obtidos em duas épocas de colheita dos frutos e olivais em
produção integrada. A separação da fracção fenólica foi feita por extracção
líquido-líquido (ELL) e a análise dos compostos fenólicos obtida por
cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) com detecção por díodos (DAD).
São também determinados: os tocoferóis por HPLC e fluorescência (FLD); os
biofenóis totais por espectroscopia VIS; e a intensidade do sabor amargo (K225)
por espectroscopia UV.
Os azeites ‘Galega’ e ‘Azeiteira’ apresentam teores mais elevados de
antioxidantes na colheita mais temporã indicando que – do ponto de vista
nutricional, sensorial e da estabilidade deste alimento – não é benéfico retardar
a época de colheita.
O hidroxitirosol e a luteolina decrescem acentuadamente na segunda
data de colheita para os azeites de cultivar ‘Azeiteira’. Os azeites ‘Galega’
apresentam teores mais elevados de α-tocoferol e ϒ-tocoferol

Gouveia, C.

Henriques, L.R.

Nunes, A.

Peres, M.F.

Vitorino, M.C.

Repositório Científico do Instituto Politécnico de Castelo Branco

V Simpósio Nacional de Olivicultura - Santarém, 24 a 26 de Setembro de 2009
Actas Portuguesas de Horticultura, n.º 14 (2011)  120  
Antioxidantes em azeites ‘Galega’ e ‘Azeiteira’ 
provenientes de frutos obtidos em duas épocas de 
colheita 
F. Peres, A. Nunes, C. Vitorino, C. Gouveia & L. Henriques 
Escola Superior Agrária de Castelo Branco, Quinta Senhora de Mércules, IPCB, Apartado 119, 6001-909 
Castelo Branco, Portugal, fperes@esa.ipcb.pt 
Resumo 
No presente trabalho são determinados os biofenóis em azeites ‘Galega’ 
e ‘Azeiteira’ obtidos em duas épocas de colheita dos frutos e olivais em 
produção integrada. A separação da fracção fenólica foi feita por extracção 
líquido-líquido (ELL) e a análise dos compostos fenólicos obtida por 
cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) com detecção por díodos (DAD). 
São também determinados: os tocoferóis por HPLC e fluorescência (FLD); os 
biofenóis totais por espectroscopia VIS; e a intensidade do sabor amargo (K225) 
por espectroscopia UV. 
Os azeites ‘Galega’ e ‘Azeiteira’ apresentam teores mais elevados de 
antioxidantes na colheita mais temporã indicando que – do ponto de vista 
nutricional, sensorial e da estabilidade deste alimento – não é benéfico retardar 
a época de colheita.  
O hidroxitirosol e a luteolina decrescem acentuadamente na segunda 
data de colheita para os azeites de cultivar ‘Azeiteira’. Os azeites ‘Galega’ 
apresentam teores mais elevados de α-tocoferol e -tocoferol. 
Palavras-chave: compostos fenólicos, azeite virgem, maturação, tocoferóis, 
HPLC. 
Abstract 
Antioxidants in 'Galega' and 'Azeiteira' olive oils from fruits of two 
harvest times 
The present paper evaluates the content of biophenols in ‘Galega’ and 
‘Azeiteira’ virgin olive oils for two harvest times, in olive groves submitted to 
Integrated Production. Chromatographic separation was performed by liquid-
liquid extraction (LLE) and analysis carried out by high performance liquid 
chromatography (HPLC) and diode array detector (DAD).Tocopherols content 
was evaluated by HPLC and fluorescence detector (FLD); total biophenols by 
VIS spectroscopy; and intensity of bitter taste (K225) by UV spectroscopy.  
‘Galega’ and ‘Azeiteira’ olive oils showed higher antioxidant contents 
for earlier stages of ripening indicating that retarding the harvest has no 
practical advantages on what concerns nutritional, sensory and food stability.  
V Simpósio Nacional de Olivicultura - Santarém, 24 a 26 de Setembro de 2009 
Actas Portuguesas de Horticultura, n.º 14 (2011)  121  
Hydroxytyrosol and luteolin contents decrease in the second harvest 
time for ‘Azeiteira’ olive oil. ‘Galega’ virgin olive oils showed higher contents of 
α-tocopherol and -tocopherol. 
Keywords: phenol compounds, virgin olive oil, ripening, tocopherols, HPLC. 
Introdução 
Os componentes menores do azeite virgem incluem diversos esteróis, 
alcoóis alifáticos e triterpénicos, hidrocarbonetos, compostos voláteis e 
antioxidantes. Os principais compostos antioxidantes do azeite virgem são 
fenóis. A actividade dos fenóis está relacionada com a estabilidade oxidativa do 
azeite e com a intensidade do seu sabor amargo (Servili et al., 2004). Os fenóis 
lipofílicos – os tocoferóis – ocorrem vulgarmente em outros óleos vegetais; os 
fenóis hidrofílicos – aqui designados por biofenóis – são específicos do azeite e 
constituem um grupo de metabolitos secundários com importantes 
propriedades sensoriais e nutricionais. De acordo com diversos estudos, a 
cultivar e o estado de maturação das azeitonas constituem os dois factores 
preponderantes do teor de biofenóis nos azeites virgens obtidos de frutos sãos 
(Aparício & Morales, 1998; Servili et al., 2004; Beltran et al., 2005). 
A análise por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) para 
determinar fenóis em azeites e a sua separação em diversas classes de 
compostos fenólicos (ácidos fenólicos, alcoóis fenólicos, flavonóides, 
secoridoides e lignanos) tem sido objecto de numerosos estudos e revisões 
(Hrncirik & Fritsche, 2004; Bendini et al., 2007). 
O presente trabalho determina o teor em antioxidantes – biofenóis e 
tocoferóis – de azeites monovarietais produzidos a partir de frutos colhidos em 
duas épocas de colheita (dois estados de maturação distintos) por HPLC. 
Apresenta ainda os valores das absorvâncias a 225 nm, reconhecidos 
vulgarmente por intensidade do sabor amargo. 
Material e Métodos 
Foram seleccionados para este estudo dois olivais em Produção 
Integrada, um localizado na região de Azeite da Beira Baixa DOP, de cultivar 
‘Galega Vulgar’ (olival de seis anos), e um localizado na região de Azeites do 
Norte Alentejano DOP (olival de cerca de 40 anos) de cultivar ‘Azeiteira’.  
O presente estudo reporta-se a três anos de produção: 2004, 2005 e 
2006. Em cada campanha procedeu-se a duas recolhas de frutos: uma no final 
do mês de Outubro e outra em Novembro, cerca de 15 dias após a primeira 
recolha. A época de colheita foi decidida de acordo com o índice de maturação 
das azeitonas (IM > 3,5) e a estabilização do teor em gordura (ms). A extracção 
de azeite foi realizada em sistema OLIOMIO 50.  
As determinações analíticas seguiram diversas metodologias.  
V Simpósio Nacional de Olivicultura - Santarém, 24 a 26 de Setembro de 2009 
Actas Portuguesas de Horticultura, n.º 14 (2011)  122  
A determinação de biofenóis totais fez-se por extracção líquido-líquido 
(ELL) e quantificação por espectroscopia VIS, utilizando reagente de Folin 
Ciocalteau.  
A avaliação da absorvância a 225 nm (K225) obteve-se por extracção 
dos compostos fenólicos em fase sólida com colunas C18 e leitura 
espectrofotométrica do extracto a 225 nm (Gutiérrez-Rosales et al., 1992).  
Os tocoferóis foram determinados por HPLC (NP-HPLC), em 
cromatógrafo Agilent 1100 Series com detecção por fluorescência (excitação a 
290 nm e emissão a 330 nm), coluna Lichrosorb Si 60 (5 m), volume de 
injecção 20 μl, eluição isocrática com n-hexano e 2-propanol (99,5:0,5 v/v), 
fluxo 1,2 ml/min e quantificação por padrão externo. 
Os biofenóis foram analisados por HPLC. A extracção fenólica foi feita 
por ELL com base no procedimento descrito por Montedoro et al. (1992), 
contudo com concentração das amostras em Speedvac®, modelo SPD121P 
(Thermo Savant). O extracto fenólico foi solubilizado com 2 ml de metanol e 
filtrado com filtros Acrodisc® 0,45 μm, 25 mm (Pall Gelman Laboratory). A 
análise foi conduzida em cromatógrafo Agilent 1100 Series, detector de díodos 
(DAD), λ = 278 nm, coluna Purospher® STAR RP-18 (Merck), 250 mm x 4 mm, 
volume de injecção de 20 μl e fluxo de 1,0 ml/min. A fase móvel foi constituída 
por: solvente A, 0,2% de ácido acético em água (pH=3,1); solvente B, metanol; 
eluição com gradiente de concentração. Foram quantificados 8 compostos 
fenólicos por padrão externo.  
No tratamento dos resultados foi utilizado o procedimento General 
Linear Models do programa SPSS 16 para Windows. 
Em 2006, não houve produção de azeite ‘Azeiteira’. As análises de 
biofenóis por HPLC foram efectuadas apenas para azeites da época 2005. 
Resultados e Discussão 
Todos os azeites do presente estudo foram classificados como azeites 
virgem extra face ao Regulamento (CE) N.º1989/2003) (valores médios: acidez 
<0,4 g/100 g; Índice de Peróxido <13 meq O2 kg-1; K270 <0,150 e K232 <1,78; 
ausência de defeitos sensoriais e intensidade de frutado >3,6).  
A figura 1 apresenta os resultados globais (3 campanhas) dos teores de 
biofenóis totais dos azeites ‘Azeiteira’ e ‘Galega’ nas colheitas de Outubro e 
Novembro, com índices de maturação médios de 4 e 5. Observa-se teores 
menores na época de Novembro e o decrescimento é maior nos azeites 
‘Azeiteira’.  
A figura 2 apresenta os resultados da intensidade do sabor amargo 
(K225). Estes valores observam uma correspondência evidente com os teores de 
biofenóis totais: são inicialmente mais elevados nos azeites ‘Azeiteira’ e 
decrescem de Outubro para Novembro mais acentuadamente nestes azeites. 
Não foram atingidos valores de K225 > 0,360, valor referido por Gutiérrez-
Rosales et al. (1992), como correspondentes a azeites extremamente amargos, 
preteridos pela maioria dos consumidores.  
V Simpósio Nacional de Olivicultura - Santarém, 24 a 26 de Setembro de 2009 
Actas Portuguesas de Horticultura, n.º 14 (2011)  123  
O quadro1 revela que os azeites ‘Galega’ são mais ricos em tocoferóis 
que os azeites Azeiteira, distinguindo-se significativamente entre si (P<0,001) 
pelos teores de alfa e gama tocoferol. A evolução destes antioxidantes não 
depende tanto da época de colheita como dependem os teores de biofenóis, 
resultados também obtidos por outros autores (Gimeno et al., 2002). 
As figuras 3 e 4 mostram cromatogramas HPLC de biofenóis de dois 
azeites ‘Azeiteira’ obtidos nos dois momentos distintos de maturação. Pode 
observar-se mais picos cromatográficos e uma maior área para a maioria dos 
mesmos na colheita de Outubro.  
O quadro 2 apresenta os resultados relativos aos teores dos diferentes 
biofenóis quantificados; os teores de hidroxitirosol, tirosol e luteolina 
distinguem significativamente (P<0,05) os azeites ‘Galega’ e ‘Azeiteira’ e 
diminuem com o aumento da maturação; resultado oposto foi obtido por 
Brenes et al. (1999). Nos azeites Azeiteira verifica-se a diminuição mais 
acentuada de hidroxitirosol, composto fenólico de grande importância para a 
saúde humana (Boskou et al., 2005; Bendini et al., 2007).  
O presente estudo corrobora a importância da época de colheita e 
consequentemente do estado de maturação da azeitona como um factor que 
influencia claramente as características nutricionais e sensoriais do azeite 
virgem. A menor quantidade de antioxidantes fenólicos para colheitas mais 
tardias indica que não há qualquer vantagem em protelar a época de colheita da 
azeitona, a partir do momento em que a biossíntese de toda a gordura foi 
atingida. 
Agradecimentos 
Este trabalho foi financiado pela Medida 8.1 do Programa Agro, 
Projecto 463: “Segurança e qualidade alimentar em produtos do olival”. Os 
autores agradecem aos membros da equipa do projecto que colaboraram na 
colheita de amostras, nomeadamente J.Coutinho, C. Amaro e P. Fragoso. 
Referências 
Aparicio, R. & Morales, M.T. 1998. Characterization of olive ripeness by green 
aroma compounds of virgin olive oil. J. Agric. Food Chem., 46:1116-1122. 
Beltrán, G., Aguilera, M., Del Riob, P.C., Sanchez, S. & Martinez, L. 2005. Influence 
of fruit ripening process on the natural antioxidant content of hojiblanca 
virgin olive oils. Food Chemistry 89:207-215. 
Bendini, A., Cerretini, L., Carrasco-Pancorbo, A., Caravaca, A.M.G., Segura-
Carretero, A., Fernández-Gutiérrez, A. & Lercker, G. 2007. Phenolic 
molecules in virgin olive oils: A survey of their sensory properties, health 
effects, antioxidant activity and analytical methods. An overview of the last 
decade. Molecules, 12:1679-1719. 
Boskou, D., Blekas, G. & Tsimidou, M. 2005. Phenolic compounds in olive oil and 
olives. Curr. Topics Nutraceutical Res., 3:125-136  
V Simpósio Nacional de Olivicultura - Santarém, 24 a 26 de Setembro de 2009
Actas Portuguesas de Horticultura, n.º 14 (2011)  124  
Brenes, M., Garcia, A., Garcia, P., Rios, J.J. & Garrido, A. 1999. Phenolic 
compounds in spanish olive oils. J. Agric. Food Chem., 47:3535-3540. 
Gimeno, E., Castellote, A.I., Lamuela-Raventós, R.M., De la Torre, M.C. & López-
Sabater, M.C. 2002. The effects of harvest and extraction methods on the 
antioxidant content (phenolics, α-tocopherol, and β-carotene) in virgin olive 
oil. Food Chem., 78:207-211. 
Gutiérrez-Rosales, F., Perdiguero, S., Gutiérrez, R. & Olias, J.M. 1992. Evaluation 
of the bitter taste in virgin olive oil. J. Am. Oil Chem. Soc., 69:1558-9331. 
Hrncirik, K. & Fritsche, S. 2004. Comparability and reliability of different 
techniques for the determination of phenolic compounds in virgin olive oil. 
Eur. J. of Lipid Sci. and Tech., 106:540-549. 
Montedoro, G., Servili, M., Baldioli, M. & Miniati, E. 1992. Simple and 
hydrolyzable phenolic compounds in virgin olive oil. 1. Their extraction, 
separation, and quantitative and semiquantitative evaluation by hplc. J. 
Agric. Food Chem., 40:1571-1576. 
Servili, M., Selvaggini, R., Esposto, S., Taticchi, A., Montedoro, G.F. & Morozzi, G. 
2004. Health and sensory properties of virgin olive oil hydrophilic phenols: 
Agronomic and technological aspects of production that affect their 
occurrence in the oil. J. Chromatogr. A, 1054:113-127. 
 
 
 
 
Quadro 1 - Teores em tocoferóis (mg kg-1) nas 3 campanhas. (Valores médios  desvio 
padrão). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Cultivar Época de Colheita Alfa-Tocoferol Beta-tocoferol Gama-tocoferol 
     
‘Azeiteira’ Out (IM= 4) 134,4   9,74  1,0  0,36 1,3  0,43  
 Nov (IM= 5) 114,9  38,73 1,7  0,19 2,5 1,63 
     
‘Galega’ Out (IM= 4) 147,8  11,47 1,5  0,60 6,7 1,12 
 Nov (IM= 5) 150,6  16,80 2,4  1,16 6,4  1,88 
     
 
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Actas Portuguesas de Horticultura, n.º 14 (2011)  125  
 
 
 
Quadro 2 - Teores em biofenóis (mg kg-1) na campanha de 2005. (Valores médios  
desvio padrão). 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1- Teores de biofenóis totais (mg kg-1) nas 3 campanhas.  
(Valores médios  desvio padrão) 
 
 
 
 
 Galega Out Galega Nov Azeiteira Out Azeiteira Nov 
Hidroxitirosol 1,47 ± 0,058 1,22 ± 0,052 5,60 ± 0,092 2,69 ± 0,078 
Tirosol 5,61 ± 0,242 5,66 ± 0,244 11,19 ± 0,305 10,38 ± 0,315 
Ác. vanílico 0,26 ± 0,013 0,44 ± 0,019 0,39 ± 0,010 0,35 ± 0,015 
Vanilina 0,11 ± 0,004 0,18 ± 0,005 0,09 ± 0,014 0,09 ± 0,014 
Ác. p-cumárico 0,17 ± 0,007 0,21 ± 0,010 0,32 ± 0,005 0,77 ± 0,046 
Ác. o-cumárico 0,23 ± 0,049 0,20 ± 0,003 0,67 ± 0,028 0,11 ± 0,012 
Ác. cinâmico 0,28 ± 0,051 0,10 ± 0,009 0,04 ± 0,017 0,12 ± 0,012 
Luteolina 1,49 ± 0,156 1,22 ± 0,089 5,01 ± 0,702 1,49 ± 0,147 
Apigenina 0,98 ± 0,122 1,29 ± 0,182 1,36 ± 0,008 1,65 ± 0,176 
 
 
IMOut= 4; IMNov =5
0
50
100
150
200
250
Out Nov Out Nov
Azeiteira Galega
B
io
fe
n
ó
is
 (
m
g
 K
g
-1
)
V Simpósio Nacional de Olivicultura - Santarém, 24 a 26 de Setembro de 2009
Actas Portuguesas de Horticultura, n.º 14 (2011)  126  
 
 
 
 
 
Figura 2 - Absorvâncias a 225 nm (K225) nas 3 campanhas.  
(Valores médios  desvio padrão) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3 - Cromatograma de um azeite ‘Azeiteira’, Outubro de 2005, λ = 278 nm. 1 – 
hidroxitirosol; 2 – tirosol; 3 – ácido vanílico; 4 – ácido p-cumárico; 5 – ácido o-cumárico; 
a – desconhecido; 6 – luteolina; 7 – apigenina. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 4 - Cromatograma de um azeite ‘Azeiteira’, Novembro de 2005, λ = 278 nm. 1 – 
hidroxitirosol; 2 – tirosol 3 – ácido vanílico; 4 – ácido p-cumárico; a – desconhecido; 5 – 
ácido cinâmico; 6 – luteolina; 7 – apigenina. 
 
  
 
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
Out Nov Out Nov
Azeiteira Galega
K
2
2
5
 
1 
2 
3 4 
5 
6 
7 
IM = 4,09 
a 
 
a 
IM = 5,32 
1 
2 
3 
4 
5 
6 
7 


Portuguese

Antioxidantes em azeites ‘Galega’ e ‘Azeiteira’ provenientes de frutos obtidos em duas épocas de colheita

Repositório do Instituto Politécnico de Castelo Branco

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Os azeites ‘Galega’ e ‘Azeiteira’ apresentam teores mais elevados de antioxidantes na colheita mais temporã indicando que – do ponto de vista nutricional, sensorial e da estabilidade deste alimento – não é benéfico retardar a época de colheita.  O hidroxitirosol e a luteolina decrescem acentuadamente na segunda data de colheita para os azeites de cultivar ‘Azeiteira’. Os azeites ‘Galega’ apresentam teores mais elevados de α-tocoferol e -tocoferol. Palavras-chave: compostos fenólicos, azeite virgem, maturação, tocoferóis, HPLC. Abstract Antioxidants in 'Galega' and 'Azeiteira' olive oils from fruits of two harvest times The present paper evaluates the content of biophenols in ‘Galega’ and ‘Azeiteira’ virgin olive oils for two harvest times, in olive groves submitted to Integrated Production. Chromatographic separation was performed by liquid-liquid extraction (LLE) and analysis carried out by high performance liquid chromatography (HPLC) and diode array detector (DAD).Tocopherols content was evaluated by HPLC and fluorescence detector (FLD); total biophenols by VIS spectroscopy; and intensity of bitter taste (K225) by UV spectroscopy.  ‘Galega’ and ‘Azeiteira’ olive oils showed higher antioxidant contents for earlier stages of ripening indicating that retarding the harvest has no practical advantages on what concerns nutritional, sensory and food stability.  V Simpósio Nacional de Olivicultura - Santarém, 24 a 26 de Setembro de 2009 Actas Portuguesas de Horticultura, n.º 14 (2011)  121  Hydroxytyrosol and luteolin contents decrease in the second harvest time for ‘Azeiteira’ olive oil. ‘Galega’ virgin olive oils showed higher contents of α-tocopherol and -tocopherol. Keywords: phenol compounds, virgin olive oil, ripening, tocopherols, HPLC. Introdução Os componentes menores do azeite virgem incluem diversos esteróis, alcoóis alifáticos e triterpénicos, hidrocarbonetos, compostos voláteis e antioxidantes. Os principais compostos antioxidantes do azeite virgem são fenóis. A actividade dos fenóis está relacionada com a estabilidade oxidativa do azeite e com a intensidade do seu sabor amargo (Servili et al., 2004). Os fenóis lipofílicos – os tocoferóis – ocorrem vulgarmente em outros óleos vegetais; os fenóis hidrofílicos – aqui designados por biofenóis – são específicos do azeite e constituem um grupo de metabolitos secundários com importantes propriedades sensoriais e nutricionais. De acordo com diversos estudos, a cultivar e o estado de maturação das azeitonas constituem os dois factores preponderantes do teor de biofenóis nos azeites virgens obtidos de frutos sãos (Aparício & Morales, 1998; Servili et al., 2004; Beltran et al., 2005). A análise por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) para determinar fenóis em azeites e a sua separação em diversas classes de compostos fenólicos (ácidos fenólicos, alcoóis fenólicos, flavonóides, secoridoides e lignanos) tem sido objecto de numerosos estudos e revisões (Hrncirik & Fritsche, 2004; Bendini et al., 2007). O presente trabalho determina o teor em antioxidantes – biofenóis e tocoferóis – de azeites monovarietais produzidos a partir de frutos colhidos em duas épocas de colheita (dois estados de maturação distintos) por HPLC. Apresenta ainda os valores das absorvâncias a 225 nm, reconhecidos vulgarmente por intensidade do sabor amargo. Material e Métodos Foram seleccionados para este estudo dois olivais em Produção Integrada, um localizado na região de Azeite da Beira Baixa DOP, de cultivar ‘Galega Vulgar’ (olival de seis anos), e um localizado na região de Azeites do Norte Alentejano DOP (olival de cerca de 40 anos) de cultivar ‘Azeiteira’.  O presente estudo reporta-se a três anos de produção: 2004, 2005 e 2006. Em cada campanha procedeu-se a duas recolhas de frutos: uma no final do mês de Outubro e outra em Novembro, cerca de 15 dias após a primeira recolha. A época de colheita foi decidida de acordo com o índice de maturação das azeitonas (IM > 3,5) e a estabilização do teor em gordura (ms). A extracção de azeite foi realizada em sistema OLIOMIO 50.  As determinações analíticas seguiram diversas metodologias.  V Simpósio Nacional de Olivicultura - Santarém, 24 a 26 de Setembro de 2009 Actas Portuguesas de Horticultura, n.º 14 (2011)  122  A determinação de biofenóis totais fez-se por extracção líquido-líquido (ELL) e quantificação por espectroscopia VIS, utilizando reagente de Folin Ciocalteau.  A avaliação da absorvância a 225 nm (K225) obteve-se por extracção dos compostos fenólicos em fase sólida com colunas C18 e leitura espectrofotométrica do extracto a 225 nm (Gutiérrez-Rosales et al., 1992).  Os tocoferóis foram determinados por HPLC (NP-HPLC), em cromatógrafo Agilent 1100 Series com detecção por fluorescência (excitação a 290 nm e emissão a 330 nm), coluna Lichrosorb Si 60 (5 m), volume de injecção 20 μl, eluição isocrática com n-hexano e 2-propanol (99,5:0,5 v/v), fluxo 1,2 ml/min e quantificação por padrão externo. Os biofenóis foram analisados por HPLC. A extracção fenólica foi feita por ELL com base no procedimento descrito por Montedoro et al. (1992), contudo com concentração das amostras em Speedvac®, modelo SPD121P (Thermo Savant). O extracto fenólico foi solubilizado com 2 ml de metanol e filtrado com filtros Acrodisc® 0,45 μm, 25 mm (Pall Gelman Laboratory). A análise foi conduzida em cromatógrafo Agilent 1100 Series, detector de díodos (DAD), λ = 278 nm, coluna Purospher® STAR RP-18 (Merck), 250 mm x 4 mm, volume de injecção de 20 μl e fluxo de 1,0 ml/min. A fase móvel foi constituída por: solvente A, 0,2% de ácido acético em água (pH=3,1); solvente B, metanol; eluição com gradiente de concentração. Foram quantificados 8 compostos fenólicos por padrão externo.  No tratamento dos resultados foi utilizado o procedimento General Linear Models do programa SPSS 16 para Windows. Em 2006, não houve produção de azeite ‘Azeiteira’. As análises de biofenóis por HPLC foram efectuadas apenas para azeites da época 2005. Resultados e Discussão Todos os azeites do presente estudo foram classificados como azeites virgem extra face ao Regulamento (CE) N.º1989/2003) (valores médios: acidez <0,4 g/100 g; Índice de Peróxido <13 meq O2 kg-1; K270 <0,150 e K232 <1,78; ausência de defeitos sensoriais e intensidade de frutado >3,6).  A figura 1 apresenta os resultados globais (3 campanhas) dos teores de biofenóis totais dos azeites ‘Azeiteira’ e ‘Galega’ nas colheitas de Outubro e Novembro, com índices de maturação médios de 4 e 5. Observa-se teores menores na época de Novembro e o decrescimento é maior nos azeites ‘Azeiteira’.  A figura 2 apresenta os resultados da intensidade do sabor amargo (K225). Estes valores observam uma correspondência evidente com os teores de biofenóis totais: são inicialmente mais elevados nos azeites ‘Azeiteira’ e decrescem de Outubro para Novembro mais acentuadamente nestes azeites. Não foram atingidos valores de K225 > 0,360, valor referido por Gutiérrez-Rosales et al. (1992), como correspondentes a azeites extremamente amargos, preteridos pela maioria dos consumidores.  V Simpósio Nacional de Olivicultura - Santarém, 24 a 26 de Setembro de 2009 Actas Portuguesas de Horticultura, n.º 14 (2011)  123  O quadro1 revela que os azeites ‘Galega’ são mais ricos em tocoferóis que os azeites Azeiteira, distinguindo-se significativamente entre si (P<0,001) pelos teores de alfa e gama tocoferol. A evolução destes antioxidantes não depende tanto da época de colheita como dependem os teores de biofenóis, resultados também obtidos por outros autores (Gimeno et al., 2002). As figuras 3 e 4 mostram cromatogramas HPLC de biofenóis de dois azeites ‘Azeiteira’ obtidos nos dois momentos distintos de maturação. Pode observar-se mais picos cromatográficos e uma maior área para a maioria dos mesmos na colheita de Outubro.  O quadro 2 apresenta os resultados relativos aos teores dos diferentes biofenóis quantificados; os teores de hidroxitirosol, tirosol e luteolina distinguem significativamente (P<0,05) os azeites ‘Galega’ e ‘Azeiteira’ e diminuem com o aumento da maturação; resultado oposto foi obtido por Brenes et al. (1999). Nos azeites Azeiteira verifica-se a diminuição mais acentuada de hidroxitirosol, composto fenólico de grande importância para a saúde humana (Boskou et al., 2005; Bendini et al., 2007).  O presente estudo corrobora a importância da época de colheita e consequentemente do estado de maturação da azeitona como um factor que influencia claramente as características nutricionais e sensoriais do azeite virgem. A menor quantidade de antioxidantes fenólicos para colheitas mais tardias indica que não há qualquer vantagem em protelar a época de colheita da azeitona, a partir do momento em que a biossíntese de toda a gordura foi atingida. Agradecimentos Este trabalho foi financiado pela Medida 8.1 do Programa Agro, Projecto 463: “Segurança e qualidade alimentar em produtos do olival”. Os autores agradecem aos membros da equipa do projecto que colaboraram na colheita de amostras, nomeadamente J.Coutinho, C. Amaro e P. Fragoso. Referências Aparicio, R. & Morales, M.T. 1998. Characterization of olive ripeness by green aroma compounds of virgin olive oil. J. Agric. Food Chem., 46:1116-1122. Beltrán, G., Aguilera, M., Del Riob, P.C., Sanchez, S. & Martinez, L. 2005. Influence of fruit ripening process on the natural antioxidant content of hojiblanca virgin olive oils. Food Chemistry 89:207-215. Bendini, A., Cerretini, L., Carrasco-Pancorbo, A., Caravaca, A.M.G., Segura-Carretero, A., Fernández-Gutiérrez, A. & Lercker, G. 2007. Phenolic molecules in virgin olive oils: A survey of their sensory properties, health effects, antioxidant activity and analytical methods. An overview of the last decade. Molecules, 12:1679-1719. Boskou, D., Blekas, G. & Tsimidou, M. 2005. Phenolic compounds in olive oil and olives. Curr. Topics Nutraceutical Res., 3:125-136  V Simpósio Nacional de Olivicultura - Santarém, 24 a 26 de Setembro de 2009Actas Portuguesas de Horticultura, n.º 14 (2011)  124  Brenes, M., Garcia, A., Garcia, P., Rios, J.J. & Garrido, A. 1999. Phenolic compounds in spanish olive oils. J. Agric. Food Chem., 47:3535-3540. Gimeno, E., Castellote, A.I., Lamuela-Raventós, R.M., De la Torre, M.C. & López-Sabater, M.C. 2002. The effects of harvest and extraction methods on the antioxidant content (phenolics, α-tocopherol, and β-carotene) in virgin olive oil. Food Chem., 78:207-211. Gutiérrez-Rosales, F., Perdiguero, S., Gutiérrez, R. & Olias, J.M. 1992. Evaluation of the bitter taste in virgin olive oil. J. Am. Oil Chem. Soc., 69:1558-9331. Hrncirik, K. & Fritsche, S. 2004. Comparability and reliability of different techniques for the determination of phenolic compounds in virgin olive oil. Eur. J. of Lipid Sci. and Tech., 106:540-549. Montedoro, G., Servili, M., Baldioli, M. & Miniati, E. 1992. Simple and hydrolyzable phenolic compounds in virgin olive oil. 1. Their extraction, separation, and quantitative and semiquantitative evaluation by hplc. J. Agric. Food Chem., 40:1571-1576. Servili, M., Selvaggini, R., Esposto, S., Taticchi, A., Montedoro, G.F. & Morozzi, G. 2004. Health and sensory properties of virgin olive oil hydrophilic phenols: Agronomic and technological aspects of production that affect their occurrence in the oil. J. Chromatogr. A, 1054:113-127.     Quadro 1 - Teores em tocoferóis (mg kg-1) nas 3 campanhas. (Valores médios  desvio padrão).              Cultivar Época de Colheita Alfa-Tocoferol Beta-tocoferol Gama-tocoferol      ‘Azeiteira’ Out (IM= 4) 134,4   9,74  1,0  0,36 1,3  0,43   Nov (IM= 5) 114,9  38,73 1,7  0,19 2,5 1,63      ‘Galega’ Out (IM= 4) 147,8  11,47 1,5  0,60 6,7 1,12  Nov (IM= 5) 150,6  16,80 2,4  1,16 6,4  1,88       V Simpósio Nacional de Olivicultura - Santarém, 24 a 26 de Setembro de 2009Actas Portuguesas de Horticultura, n.º 14 (2011)  125     Quadro 2 - Teores em biofenóis (mg kg-1) na campanha de 2005. (Valores médios  desvio padrão).        Figura 1- Teores de biofenóis totais (mg kg-1) nas 3 campanhas.  (Valores médios  desvio padrão)      Galega Out Galega Nov Azeiteira Out Azeiteira Nov Hidroxitirosol 1,47 ± 0,058 1,22 ± 0,052 5,60 ± 0,092 2,69 ± 0,078 Tirosol 5,61 ± 0,242 5,66 ± 0,244 11,19 ± 0,305 10,38 ± 0,315 Ác. vanílico 0,26 ± 0,013 0,44 ± 0,019 0,39 ± 0,010 0,35 ± 0,015 Vanilina 0,11 ± 0,004 0,18 ± 0,005 0,09 ± 0,014 0,09 ± 0,014 Ác. p-cumárico 0,17 ± 0,007 0,21 ± 0,010 0,32 ± 0,005 0,77 ± 0,046 Ác. o-cumárico 0,23 ± 0,049 0,20 ± 0,003 0,67 ± 0,028 0,11 ± 0,012 Ác. cinâmico 0,28 ± 0,051 0,10 ± 0,009 0,04 ± 0,017 0,12 ± 0,012 Luteolina 1,49 ± 0,156 1,22 ± 0,089 5,01 ± 0,702 1,49 ± 0,147 Apigenina 0,98 ± 0,122 1,29 ± 0,182 1,36 ± 0,008 1,65 ± 0,176   IMOut= 4; IMNov =5050100150200250Out Nov Out NovAzeiteira GalegaBiofenóis (mg Kg-1)V Simpósio Nacional de Olivicultura - Santarém, 24 a 26 de Setembro de 2009Actas Portuguesas de Horticultura, n.º 14 (2011)  126       Figura 2 - Absorvâncias a 225 nm (K225) nas 3 campanhas.  (Valores médios  desvio padrão)          Figura 3 - Cromatograma de um azeite ‘Azeiteira’, Outubro de 2005, λ = 278 nm. 1 – hidroxitirosol; 2 – tirosol; 3 – ácido vanílico; 4 – ácido p-cumárico; 5 – ácido o-cumárico; a – desconhecido; 6 – luteolina; 7 – apigenina.           Figura 4 - Cromatograma de um azeite ‘Azeiteira’, Novembro de 2005, λ = 278 nm. 1 – hidroxitirosol; 2 – tirosol 3 – ácido vanílico; 4 – ácido p-cumárico; a – desconhecido; 5 – ácido cinâmico; 6 – luteolina; 7 – apigenina.     00,050,10,150,20,250,30,35Out Nov Out NovAzeiteira GalegaK225 1 2 3 4 5 6 7 IM = 4,09 a  a IM = 5,32 1 2 3 4 5 6 7 

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Antioxidantes em azeites ‘Galega’ e ‘Azeiteira’ provenientes de frutos obtidos em duas épocas de colheita

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