A produção de embriões em ovinos é uma tarefa difícil, exigindo experiência e condições onerosas, principalmente na
produção de embriões in vivo. A recolha sistemática de oócitos em animais de matadouro ou em animais vivos por ovum
pick-up, permite a produção in vitro de embriões (IVP), em larga escala e menos dispendiosa, nos pequenos ruminantes.
Esta possibilidade é importante não só como fonte de embriões mas também de oócitos e zigotos para fins comerciais ou de
investigação, facilitando a sua disponibilidade em tecnologias emergentes tais como a clonagem ou a transgénese. Para IVP
foram desenvolvidos vários protocolos de maturação, utilizando fertilização in vitro (IVF) com sémen fresco ou congelado.
Em Portugal, a produção de embriões in vitro foi somente realizada com sémen congelado dada a sua disponibilidade em
condições de rotina. Contudo, o sémen fresco poderá melhorar a produção de embriões frescos ou criopreservados.
Este trabalho teve como objectivo comparar a eficiência da IVP em ovinos usando diferentes protocolos de maturação de
oócitos e IVF com sémen fresco ou congelado. Oócitos (n=1768) recolhidos em matadouro foram maturados em meio
TCM199 com 100 μM cisteamine, 10 ng mL-1 EGF, 10 μg mL-1 E2 e gentamicina (mat A, n=692) ou suplementada com
10 μg mL-1 FSH e 0,3 mM piruvato de sódio (mat B, n=707) a 39 ºC e 5% CO2 durante 22h. O sémen fresco (FS) e
congelado/descongelado (TS) de carneiros de raça Merino Branco (n=3) foi lavado ou submetido a swim-up,
respectivamente. Após a fertilização (18h p.i.), os presumíveis zigotos foram cultivados em meio de fluido sintético do
oviducto (SOF) enriquecido com aminoácidos e BSA a 38,5 ºC, em atmosfera humidificada com 5% O2, 5% CO2 e 90% N2
até ao estadio de 2-4-8 células. Após clivagem, o desenvolvimento embrionário prosseguiu até ao estadio de blastocisto em
meio SOF, BSA e 10% FCS. A qualidade foi avaliada no dia 6-7, classificando-se como bons, médios e maus, baseado nos
parâmetros IETS. Os dados das taxas de produção embrionária foram analisados utilizando ANOVA. Foi utilizado o teste
de Mann-Whitney U para avaliação da qualidade dos embriões.
Os diferentes protocolos de maturação não interferiram (p>0,05) quer com as taxas de maturação quer com as taxas de
produção de embriões. A qualidade embrionária foi superior (p=0,004) na fertilização com sémen fresco (bom:
FS=40,1±8,0% vs TS=32,9±5,6%; média: FS=20,1±4,7% vs TS=35,7±5,8%; má: FS=39,8±9,8% vs TS=31,4±7,6%).
Em conclusão, estes resultados preliminares mostram que o sémen fresco de carneiro pode ser facilmente utilizado
para fertilização in vitro e melhora a qualidade dos embriões produzidos.#Embryo production in sheep is a difficult task demanding experience and expensive facilities, particularly when dealing
with in vivo embryo production. Easy ways to obtain ovine embryos consist of collecting oocytes at slaughterhouses or
systematically pick them up from live animals, allowing a large scale and cheaper in vitro embryo production (IVP) for
small ruminants. Those are important sources of embryos, oocytes and zygotes for commercial, laboratorial and research
proposes, making easier the availability of resources for emerging techniques like cloning or transgenesis. For IVP, several
oocyte maturation protocols have been developed using fertilization (IVF) either with fresh or frozen-thawed semen. In
Portugal, IVP has been done through IVF using cryopreserved semen because it is easily available for routine use.
However, the use of fresh semen could improve embryo production and cryopreservation results.
The aim of this work was to compare the efficiency of in vitro embryo production in ovine using different oocyte
maturation protocols and fresh or frozen semen for IVF.
Abattoir-derived oocytes (n=1768) were matured in TCM199, 10 μM cysteamine, 10 ng mL-1 EGF, 10 μg mL-1 E2 and
gentamicin (mat A, n=692) or plus 10 μg mL-1 FSH and 0.3 mM sodium piruvate (mat B, n=707) at 39 ºC and 5% CO2 for
22h. Prior to fertilization, either fresh (FS) or frozen/thawed (TS) semen from Merino rams (n=3) was washed or submitted
to swim-up respectively. Presumptive zygotes (18h p.i.) were cultured in synthetic oviductal fluid (SOF) enriched with
aminoacids and 6 mg mL-1 BSA at 38.5 ºC, under 5% O2, 5% CO2 and 90% N2 in an humidified atmosphere until the stage
of 2-4-8 cell embryos. After assessing cleavage, embryo development proceeded until the blastocyst stage in SOF+BSA and
10% FCS. Quality was evaluated on D6-7 by scoring embryos as good, fair and bad based on IETS guidelines. Data from
embryo production rates were analysed using ANOVA. Mann-Whitney U test was used for embryo quality evaluation.
Different maturation protocols did not interfere (P>0.05) either on maturation or on embryo quality or production rates.
Embryo quality was higher (P=0.004) when fertilization was accomplished with fresh semen (good: FS=40.1±8.0% vs
TS=32.9±5.6%; fair: FS=20.1±4.7% vs TS=35.7±5.8%; bad: FS=39.8±9.8% vs TS=31.4±7.6%).
Preliminar results show that ram fresh semen can be easily used for in vitro fertilization and improves the quality of
produced embryos