Petitpierre, E.

Repositorio da Universidade da Coruña

USO DE MARCADORES MOLECULARES EN EL ANÁLISIS CROMOSÓMICO DE LA HETEROCROMATINA Y DE SUS IMPLICACIONES EVOLUTIVAS EN INSECTOS COLEÓPTEROS E. Petitpierre Lab. Genetica, Dep. Biología Ambiental, UIB La existencia de una fracción de la cromatina que permanece condensada durante todo el ciclo celular, muestra replicación tardía de su ADN y es completa o casi completamente inactiva en la transcripción, se conoce desde hace ya muchos años y ha sido objeto de múltiples estudios. Esta fracción cromatínica, llamada heterocromatina, es facilmente observable en la profase y la interfase del ciclo celular por su heteropicnosís, es decir su tinción diferencial respecto a la fracción restante de cromatina o eucromatina. Los datos experimentales obtenidos en gran número de organismos demuestran que la heteropicnosis afecta a segmentos de la mayoría de los cromosomas o, incluso, a cromosomas enteros. Se distinguen dos tipos de heterocromatina: a) la heterocromatina constitutiva, de presencia constante en todo tipo de células, y b) la heterocromatina facultativa, variable según los tipos celulares y los estadías del desarrollo, y que por tanto no es permanente como la anterior. De estos dos tipos de heterocromatina nos vamos a centrar en el primero, que corresponde a la heterocromatina propiamente dicha, de acuerdo con la mayoría de los autores. Las regiones heterocromáticas se suelen localizar en la vecindad del centrómero (regiones pericétricas o procéntricas), en las partes distales de los cromosomas y, menos frecuentemente, en las intersticiales. El bandeo C y los bandeas con t1uorocromos, como DAPI y cromomicina A3 detectan las regiones y los cromosomas heterocromáticos de manera relativamente sencilla, y por lo que se refiere a los t1uorocromos, aportan además datos acerca de su posible heterogeneidad molecular, en cuanto a su riqueza en bases de AT o GC. La composición molecular de la heterocromatina constitutiva es ADN satélite en su mayor parte, una clase de ADN altamente repetitivo dispuesto en tan de m, con una grado de redundancia entre 104 y > 106 copias por genoma y, a menudo, con fuertes diferencias cuantitativas aún entre especies estrechamente emparentadas. Se conocen diversos métodos para separar ADN satélite del total 229 lJI SIMPOSIO CIENTÍFICO EN BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR del ADN genom1co, el mas sencillo y mas frecuentemente utilizado es el de digerir el ADN genómico con endonucleasas de restricción y realizar una electroforesis de los fragmentos resultantes de la acción hidrolítica ejercida por estas enzimas. Una vez aislados, los ADNs satélites pueden clonarse en bacterias para ser usados mas tarde, por ejemplo, como sondas en hibridaciones in situ y conocer su secuencia de nucleótidos. Se han atribuido distintas funciones a la heterocromatina constitutiva y a su equivalente molecular, el ADN satélite, relacionadas principalmente con diversas características biológicas: 1) organización cromosómica (centrómeros y telómeros), 2) metabolismo celular, 3) apareamiento cromosómico, y 4) especiación y evolución. Aunque ninguna de estas funciones ha sido completamente probada, las relacionadas con la organización y el apareamiento cromosómico parecen ser bastante verosímiles porque estan apoyadas por datos empíricos. Los coleópteros Tenebrionidae son un modelo excelente para el estudio de la heterocromatina constitutiva y el ADN satélite, como se ha demostrado por nuestros trabajos y los de otros autores publicados desde 1988. Mediante técnicas convencionales de tinción, Smith ( 1952a y 1952b) detectó bloques heterocromáticos pericéntricos muy conspicuos en paquitenos de la meiosis, en todos los cromosomas del escarabajo molinero, Tenebrio molitor, y los escarabajos de la harina, Tribolium confusum y T. castaneum. En Tenebrio molitor, aproximadamente la mitad del genoma corresponde a un ADN satélite rico en AT, cuyo monómero posee 142 pb y está muy conservado en su secuencia básica. La digestión in situ de los cromosomas de esta especie con EcoRI, extrae el ADN satélite de las regiones pericétricas de todos los cromosomas, en cantidades semejantes a las detectadas mediante la separación electroforética de los fragmentos del ADN genómico, digeridos con esta misma endonucleasa de restricción. La hibridación in situ fluorescente (FISH) de este ADN satélite sobre los cromosomas de Tenebrio molitor confirma también estos resultados. No obstante, los datos obtenidos en una especie congenérica con la anterior, Tenebrio obscurus, no coinciden con aquellos, porque, en primer lugar, existen dos en vez de un solo ADN satélite, uno de 142 pb homólogo en un 80% de su secuencia al de T. molitor, y otro de 350 pb completamente distinto al precedente, y, en segundo lugar, la digestión in situ de los cromosomas de T. obscurus mediante endonucleasas de restricción que cortan y separan al ADN satélite del ADN genómico restante, no lo hacen in situ sobre la cromatina a diferencia de T. molitor, a menos que los cromosomas sean tratados previamente con proteinasa K. Por tanto, parece probable que la organización ultraestructural de la hereocromatina, por la configuración espacial propia del ADN satélite o por las interacciones entre ADN-proteinas de la heterocromatina, sea distinta en las dos especies de Tenebrio, a pesar de sus estrechas similitudes morfológicas. Se han estudiado los ADNs satélites y, en algunas especies también la heterocromatina constitutiva, de otros coleópteros tenebriónidos, cuatro especies del género Tribolium, cinco del género Pimelia, y una especie de cada uno de los siguientes géneros: Palorus, Latheticus, Alphitobius y Misolampus. En conjunto, 230 Eduard Petipierre Vall se han reunido datos sobre los ADNs satélites de 15 especies. Las cantidades de ADN satélite varían desde un 20% hasta mas de un 50% del genoma. Cada especie tiene uno o, menos frecuentemente, dos ADNs satélites propios y específicos, ricos en AT (>60% excepto en un caso), con una baja tasa de variación intraespecífica ( <5% ), y, en la mayoría, con estructuras secundarias y terciarias de orden superior, que determinan una menor movilidad electroforética en geles no desnaturalizantes de poliacrilamida, relativa a la de las secuencias lineales. Si tenemos en cuenta el tamaño de los monómeros, estos ADNs satélites pertenecen a dos grandes grupos, en uno de ellos, los monómeros o subunidades monoméricas son de 100-160 pb, y en el otro de aproximadamente 350 pb. El hecho de que todos ellos posean algún tipo de señal susceptible de ser reconocida por proteínas de la heterocromatina, como superhélice curvada, estructuras cruciformes, o grupos de A o de T, apunta hacia la posibilidad de usar estas señales como puntos de anclaje de proteínas, responsables de las propiedades específicas de la heterocromatina. Los análisis de las secuencias de nucleótidos de varios clones en diversos ADNs satélites, permiten reconocer los mecanismos implicados en su evolución. Las sustituciones nucleotídicas son mucho mas abundantes que las inserciones o deleciones de nucleótidos, pero el origen de nuevas variantes puede haberse producido por diversas causas a la vez, entrecruzamiento desigual, deslizamiento de la replicación y conversión génica, como ocurre en Alphitobius diaperinus, o unicamente por entrecruzamiento desigual en el caso de Tribolium madens y Misolampus goudoti, o por conversión génica en el de Tenehrio obscurus. Los experimentos de hibridación in situ fluorescente (FISH) en aquellas especies de tenebriónidos que presentan dos clases de ADNs satélites, hacen posible determinar su localización cromosómica en regiones heterocromáticas específicas. Así, en Misolampus goudoti, las dos clases de ADNs satélites, las familias EcoR/ y Pstl, se encuentran en las regiones pericéntricas de todos los cromosomas, pero además algunos cromosomas poseen heterocromatina subtelomérica, y en estas regiones aparece unicamente el ADN satélite Pstl. En Tenebrio obscurus, donde también existen dos clases de ADNs satélites, se observa una localización cromosómica parecida a la de Misolampus goudoti. Por tanto, se da una cierta compartimentalización de estos ADNs satélites en regiones pericéntricas y subteloméricas. Como tan solo algunos cromosomas manifiestan señales subteloméricas de hibridación, a diferencia de las pericéntricas comunes a todos ellos, cabe pensar que la localización cromosómica subtelomérica de estos ADNs satélites fué probablemente posterior y derivada de la pericéntrica. A modo de resumen, en los coleópteros tenebriónidos, la heterocromatina constitutiva y los ADNs satélites que la conforman, deben desempeñar, probablemente, un papel importante para la organización cromosómica y, quizás también, en la actividad centromérica y el apareamiento meiótico. Desde una perspectiva evolutiva, parece razonable suponer que cada especie de tenebriónido haya amplificado uno o dos tipos de secuencias de ADNs satélites de manera aleatoria, a partir de una hipotética "biblioteca" ancestral de secuencias moderadamente repetitivas, siempre y cuando estas secuencias reunieran los requisitos necesarios para poder expresarse como heterocromatina, 231 III SIMPOSIO CIENTÍFICO EN BIOLOGÍA CELULAR Y MOLECULAR en sus propiedades intrínsecas distintivas. Como cada especie suele poseer un ADN satélite peculiar y propio, las secuencias nucleotídicas no aportan ningún tipo de información susceptible de ser utilizada para establecer las relaciones filogenéticas entre especies de tenebriónidos, lo cual concuerda con los resultados obtenidos en otras especies de animales, aunque también se han descrito casos de ADNs satélites que se han conservado considerablemente a lo largo de una linea evolutiva. REFERENCIAS Smith, S.G. Chromosoma 4: 585-610 (1952a). Smith, S.G. J. Mmph. 91: 325-364 (1952b). 232 

Uso de marcadores moleculares en el análisis cromosómico de la heterocromatina y de sus implicaciones evolutivas en insectos coleópteros

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