[Abstract] New biomolecular methods allow us to reach the ancient DNA preserved in fossil bones. This paper shows first extractions of this genetic material in cave bear bones (Ursus spelaeus ) from Galicia (NW Iberian Peninsula). The sequence of mtDNA that we have got is similar to published data from French fossils (HÄNNI, 1994), although future studies will let us determinate how different the populations of this extint species are

Vila, Marta

Repositorio da Universidade da Coruña

Nota sobre el estudio de ADN antiguo en res-tos óseos de macromamíferos cuaternarios deGaliciaNote about ancient DNA studies in fossilbones from Galicia quaternary large mammalsVILA TABOADA, M.ABSTRACTNew biomolecular methods allow us to reach the ancient DNA preserved in fossil bones. Thispaper shows first extractions of this genetic material in cave bear bones (Ursus spelaeus) fromGalicia (NW Iberian Peninsula). The sequence of mtDNA that we have got is similar to publis-hed data from French fossils (HÄNNI, 1994), although future studies will let us determinatehow different the populations of this extint species are.Key words: ancient DNA, Quaternary, Ursus spelaeus, ursids, Galicia.VILA TABOADA, M. (Instituto Universitario de Xeoloxía. Universidade da Coruña. 15071. A Coruña).Cadernos Lab. Xeolóxico de LaxeCoruña. 1998. Vol. 23, pp. 263-270264 Vila Taboada, M. CAD. LAB. XEOL. LAXE 23 (1998)INTRODUCCIONLa extracción de biomoléculas en mate-riales fósiles y subfósiles ha mejorado con-siderablemente su metodología a lo largode la década de los 90, siendo la extracciónde ADN (ácido desoxirribonucleico) a par-tir de huesos, dientes, tejidos congelados,momificados etc. un campo que propor-ciona información básica tanto a nivelforense como poblacional y específico.Este trabajo presenta los primerosresultados de extracción de material gené-tico (ADN antiguo, ADNa) a partir derestos óseos de Ursus spelaeus ROSEN-MÜLLER-HEINROTH 1794 (Mammalia,Carnivora, Ursidae) (GRANDAL, 1993)recuperados con tal objetivo en el yaci-miento de Liñares Sur (Lugo, Galicia)(LOPEZ-GONZALEZ, 1996). Asimismose empleó como control del estado de con-servación del material recuperado en esteyacimiento un hueso de Cervus elaphus L.procedente de la misma excavación.Conjugando las técnicas paleontológi-cas con las empleadas por la biología mole-cular pretendemos sacar un mayor partidode la información proporcionada por losrestos fósiles. En el caso del material gené-tico de los mismos, es preciso un mínimoconocimiento del comportamiento postmortem del ADN, así señalaremos que elextraído a partir de restos antiguos es fun-damentalmente de origen mitocondrial(HILLIS, 1998) debido a la protección queestos orgánulos proporcionan a la molécu-la dentro de la propia célula y a que cadamitocondria posee un número variable decopias idénticas de la misma molécula.Una característica del mtADN —que lohace especialmente interesante para estu-dios evolutivos— es su «mayor tasa demutación», esto se explica por la menoreficiencia de la maquinaria de reparacióndel ADN en la mitocondria. Así, si unamutación no es detectada, tiene mayorprobabilidad de fijarse.Presentamos pues la recuperación departe de la secuencia de la región control(D-loop) del genoma mitocondrial deUrsus spelaeus (HÄNNI, 1994). El D-loop, o bucle de desplazamiento,es una región del genoma mitocondrial demamíferos que contiene las regiones decontrol para la replicación y transcripciónde dicho mtADN. Se le llama bucle dedesplazamiento porque durante la replica-ción, las dos cadenas de esta región sondesplazadas una respecto a la otra por unatercera cadena naciente. En esta regióncontrol existe normalmente un conjuntode secuencias conservadas que son lassupuestamente importantes para regir loscitados procesos. Dispersas entre esta zonadel genoma están las secciones no codifi-cantes que son las que parecen variar libre-mente. Estas regiones contienen lugarespolimórficos y son, por ello, el objetivo delos estudios de variabilidad intra e interes-pecíficos. (HILLIS; 1998). Otra zona delgenoma mitocondrial intensamente estu-diada desde el punto de vista evolutivo hasido el Citocromo b (IRWIN et al., 1991).Debido a que el material genético con-servado en restos fósiles suele estar fraccio-nado y en bajas concentraciones, el desa-rrollo de la Reacción en Cadena de laPolimerasa (PCR) ha supuesto un increí-ble avance en Biología Molecular permi-tiendo la posibilidad de analizar el ADNa.(PÄÄBO, 1989b). La PCR (HILLIS;1998) ha hecho posible analizar esosCAD. LAB. XEOL. LAXE 23 (1998) Nota sobre el estudio de ADN 265pequeños fragmentos de ADN (100-400pb), que se conservan en materiales fósilesy subfósiles. Dicho ADN muestra dañospor procesos de oxidación (PÄÄBO,1989a) estimándose una productividad de1-200 µg de ADN por gramo de materialde partida (hueso, diente...). Además, seconstató que las muestras extraídas a par-tir de tejidos blandos tendían a ser meno-res que aquellas recuperadas a partir dehueso o diente (HILLIS, 1998).Uno de los mayores problemas en losestudios de ADNa es, junto con la con-servación del material, la contaminacióncon otras moléculas de ADN, tanto anti-guo como moderno (otros especímenes otaxones del yacimiento, microorganis-mos, el propio investigador...). Este pro-blema puede ocurrir en cualquier fase delproceso, por ello se realizan controlesrutinarios y se sigue un protocolo estric-to referente a condiciones de trabajo.(YANG, 1998).La extracción se ha de realizar en recin-tos separados a los de la amplificación ysecuenciación, además de poseer instru-mental propio para evitar cualquier tipode contaminación con los siguientes pro-cesos. Debido a que la temperatura alcan-zada por la esterilización en autoclave nodestruye totalmente el ADN, el materialha de ser tratado con hipoclorito sódico. Seemplea material desechable (guantes, mas-carillas...) así como puntas de pipeta confiltro para evitar contaminanción por aero-sol dentro de la misma micropipeta.MATERIAL Y METODOSUna de las novedades de este estudioconsiste en la minuciosidad de la recupe-ración del material a analizar, así, la exca-vación se ha llevado a cabo del modo másaséptico posible con el fin de evitar losconsabidos problemas de contaminacionespor manipulación indebida. Por ello, elgrupo empleó guantes desechables y mas-Fig. 1. Serie de procesos seguidos para la recupera-ción de material genético a partir de restosfósiles.266 Vila Taboada, M. CAD. LAB. XEOL. LAXE 23 (1998)carillas protectoras que impidieran entodo momento el contacto de piel, muco-sas... con el hueso. Asimismo, a cada resto,inventariado in situ, fue introducido enbolsas herméticas con gel de sílice paraevitar que la humedad pudiera facilitar elcrecimiento de microorganismos y el dañopor hidrólisis.De los doce huesos recuperados especí-ficamente para la extracción de su ADNahan sido analizados tres de ellos, resulta-dos de los cuales presentamos en este tra-bajo. Asimismo se ha realizado la data-ción, por 14C AMS, de uno de los huesosanalizados.TABLA 1. Restos empleados en el análisis deADNa en este trabajo.————————————————————Especie Hueso Referencia Edad————————————————————Ursus spelaeus Metápodo L-1011 > 38.000años BPUrsus spelaeus Vértebra L-1006Cervus elaphus Metatarso L-1008————————————————————El análisis del metatarso de Cervuselaphus responde —en principio— a lanecesidad de un control del yacimiento, conel fin de verificar el estado de conservacióndel ADNa distintas muestras y detectarcontaminaciones cruzadas interespecíficasen yacimientos con varios taxones. (YANG,1998; HAGELBERG, 1994).Otra de las premisas de este tipo deestudios es la reproducibilidad de losmismos, y la verificación del análisis delmismo resto por dos laboratorios distin-tos. En nuestro caso, esto ha sido posi-ble al duplicar la Dra. Hänni el análisisdel Metápodo L-1011 realizado en ellaboratorio del Dr. Taberlet. Así pues,la extracción del material genético de lamisma muestra (L-1011) fue realizada,en cada laboratorio, por un método dis-tinto.Como ya se apuntó en la introducción,la fragmentación inicial del hueso se rea-liza del modo más aséptico posible,empleándose para el molido del granula-do resultante morteros manuales conte-niendo N2 líquido. El polvo obtenido (1-2 g) será el material de partida. La mues-tra que no se analice queda almacenada a-20ºC. Como hemos comentado se hanseguido dos métodos de extracción inde-pendientes:1. Extracción con preparados comer-ciales QIAMP Tissue (QIAGEN)—ya proporciona tubos, columnasy reactivos.2. Extracción clásica con fenol-clo-roformo, modificada deHagelberg. (HAGELBERG, E.,1994) empleando Fenol-Cloro formo-I soami l -Alcohol(GIBCO BRL Life Tech.).El primer paso de la extracción(comercial o no) consiste en una incuba-ción de la muestra en una solución tam-pón que desnaturalice las proteínas ydecalcifique el hueso. Para su preparaciónse requiere EDTA pH 8.00, Proteinasa Ky Sarcosil. Dicha incubación requiere agi-tación vertical a fin de evitar la decanta-ción del hueso.Tras la extracción del ADNa, se proce-de a la purificación de dicho material. Enel primer caso se realizó también con unkit comercial (Kit purificación pre-PCR,QIAGEN). Paralelamente, la otra purifi-CAD. LAB. XEOL. LAXE 23 (1998) Nota sobre el estudio de ADN 267cación se llevó a cabo con microcolumnasCentricon-30 (Amicon) con el fin de reti-rar las sales de la fase acuosa y concentrarla muestra por centrifugación. Esto preci-sa sucesivos lavados, así como la precau-ción previa de tomar la fase acuosa sin con-taminarla con el fenol, inhibidor de laPCR.El siguiente paso es amplificar elADN —extraído y purificado— mediantela Reacción en Cadena de la Polimerasa(PCR), técnica biomolecular para la que seemplean preparados comerciales (en nues-tro caso Perkin Elmer) conteniendo:—Taq GOLD polimerasa (enzima conmejores resultados para ADNa).—MgCl2.—dNTPs (desoxinucleótidos).—Solución tampón.—Agua.—Primers L-15995, H-16299, L-16164. Ver Tabla 2.—Seroalbúmina bovina. BSA. (Desac-tivadora de los inhibidores de la PCR).Las condiciones de amplificación sefijan en función de la marcha del proce-so. Así, aunque las condiciones de PCRtípicas para el ADN mitocondrial son35 ciclos de amplificación con desnatu-ralización a 94ºC (1 min.), anillamientoa 55ºC (1 min.) y extensión a 72 ºC (1min), estas temperaturas y tiempos seajustan en función de los parámetros queinterese optimizar (HAGELBERG;1994). De este modo, al emplear TaqGold —enzima que ha proporcionadomejores resultados en ADNa— se debeprogramar en el termociclador una des-naturalización previa al proceso con lacual (debido a la alta temperatura) laenzima arranca correctamente.Asimismo es fundamental realizar uncontrol negativo de la PCR con el fin dedetectar contaminaciones.La verificación del proceso de amplifica-ción se lleva a cabo mediante una electrofo-resis en gel de agarosa (2 %), visualizándoselas bandas —tinción con Bromuro deEtidio— en un transiluminador con luz UV.Los fragmentos de interés se determinan porsu tamaño (comparación con un marcador«ladder» comercial). Ver Fig. 2.Tras determinar cuáles son las ban-das adecuadas se procede a la secuencia-ción de la muestra correspondientesiguiendo para ello los protocolos desecuenciación directa —sin clonaje pre-vio— empleados para el secuenciadorautomático de Applied Biosystems(ABI). El programa empleado para ali-near la secuencia fue el SequenceNavigator (ABI). TABLA 2. Secuencia de los primers empleados para la amplificación de la región control (D-loop) de Ursus spelaeus. ——————————————————————————————————————————Primer Secuencia Tamaño (pb) Referencia——————————————————————————————————————————H-16299 5’-GGAGCGAGAAGAGGTACACGT-3’⇐ 21 Taberlet et al. 1994L-15995 5’- CTCCACTATCAGCACCCAAAG -3’⇒ 21L-16164 5’- GCCCCATGCATATAAGCATG -3’⇒ 20 Taberlet et al. 1994.——————————————————————————————————————————268 Vila Taboada, M. CAD. LAB. XEOL. LAXE 23 (1998)RESULTADOSAlgo que corrobora el excelente esta-do de conservación de los restos halladosen este yacimiento es —simplemente—el hecho de que, aún empleando huesostradicionalmente «difíciles» para laextracción de ADNa, como son las vér-tebras o costillas, constatamos que unaapófisis de la vértebra L-1006 presentabandas en el gel de electroforesis tan cla-ras como el metápodo L-1011.Asimismo, la literatura al respecto hablade zonas preferentes para el análisis delADN antiguo. Así, en los huesos largosse suele preferir la diáfisis, por la con-centración de tejido óseo compacto —sesupone que la densa red de trabéculasactúa como protectora del materialmitocondrial—. A pesar de todo, del L-FABLA.3. Secuencias alineadas del D-loop mitocondrial de distintos úrsidos, fósiles y actuales. (1)Metatarso de Ursus spelaeus . Hänni et al., 1994.(2) Metápodo L-1011 de Ursus spelaeus procedente del yaci-miento de Liñares Sur (Lugo, Galicia).(3) Secuencia Ursus arctus subfósil TAB7 (Hänni et al., 1994) (4) Ursus arctos actual (Cordillera Cantábrica)Taberlet &Bouvet, 1994.Nota: Sólo se muestra completa la secuencia 1, las restantes sólo señalan las diferencias con la primera.——————————————————————————————————————————10 20 30 40——————————————————————————————————————————1 TAAGCATGTA CATATTATGC TTGGTCTTAC ATGAGGACCT2 3 G T T4 G T——————————————————————————————————————————50 60 70 80——————————————————————————————————————————1 ACATTTCGAA AGTTTATTTC AAGTGTATAG TCTGTAAGCA2 XX X3 G4 C——————————————————————————————————————————90 100 110 120——————————————————————————————————————————1 TGTATTTCAC TTAGTCCGGG AGCTTAATCA CCAGGCCTCG2 X34——————————————————————————————————————————130 140——————————————————————————————————————————1 AGAAACCAGC AACCCTTGC234——————————————————————————————————————————1011 se han analizado fragmentoscorrespodientes a la epífisis obteniéndo-se resultados positivos.Presentamos en la Tabla 3 la secuen-cia obtenida alineada con la de otrosúrsidos actuales y fósiles (HÄNNI;1994. GenBank/EMBL Data Library concódigo de acceso X80259 para Ursus spe-laeus).Podemos constatar la similitud entre lasecuencia publicada y la obtenida a partirdel metápodo L-1011. Parecen existir doslugares de mutación (pb 45-48 y 98) res-pecto a la secuencia publicada a partir delos ejemplares franceses. Posteriores estu-dios verificarán si estas mutaciones sonrelevantes a nivel poblacional y desde elpunto de vista paleoecológico. Este trabajo forma parte de la TesisDoctoral de la autora.AGRADECIMIENTOSEste trabajo ha sido subvencionado concargo a los fondos de investigación proporcio-nados por el proyecto (XUGA10308A97) yrealizado bajo la supervisión del Dr. PierreTaberlet (Université Joseph Fourier.Grenoble. Francia) y Dra. Catherine Hänni(Université Lyon-1. Lyon. Francia). Deseoagradecer la ayuda y ánimos manifestados porel Dr. J. R. Vidal Romaní, Dra. AuroraGrandal d’Anglade, Fernando LópezGonzález y Odile Loreille, así como al Dr.Miguel Maestro Saavedra (SXAIN,Universidade da Coruña) y al grupo del Dr.Ángel Carracedo (Universidade de Santiagode Compostela). CAD. LAB. XEOL. LAXE 23 (1998) Nota sobre el estudio de ADN 269Fig. 2. Fotografía de un gel de electroforesis. (1)Ladder comercial. Cada banda marca frag-mentos de 100 pb. (2-4) Bandas corres-pondientes a la amplificación del mtDNAde la vértebra L-1006. (5-7) Bandas deamplificación correspondientes al metápo-do L-1011. (8) Control del yacimiento,metatarso de Cervus elaphus (9) Blanco dePCR. La ausencia de bandas supone unaamplificación correcta sin contaminación.(10-12) Controles de PCR. La ausencia debandas corroboran la no contaminaciónpor reactivos (10), condiciones del recinto(11) y micropipetas (12).BIBLIOGRAFIADERENKO, M.; MALYARCHUK, B. &SHIELDS, G. F. (1998). 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