O presente estudo integra-se num projeto mais amplo que visa avaliar o risco ambiental – que inclui os riscos ecológicos e para a saúde humana - associado a este ambiente estuarino contaminado. Em particular, este estudo teve como objetivo caracterizar o potencial citotóxico e genotóxico de sedimentos colhidos em vários locais de pesca do Estuário do Sado numa linha celular humana, tendo em vista uma avaliação de eventuais efeitos nefastos para a saúde humana

Caeiro, Sandra

Costa, Maria Helena

Costa, Pedro M.

Lavinha, João

Louro, Henriqueta

Pinto, Miguel

Silva, Maria João

Repositório Aberto da Universidade Aberta

Titulo Avaliação do potencial citotóxico e genotóxico de contaminantes de sedimentos do Estuário do Sado numa linha celular humana* Autores Miguel Pinto1, Pedro Manuel Costa 1,2, Henriqueta Louro1, Maria Helena Costa2, João Lavinha1, Sandra Caeiro2,3,4, Maria João Silva1 1Departamento de Genética Humana, Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, I.P., Av. Padre Cruz, 1649–016 Lisboa, Portugal 2IMAR — Instituto do Mar, Departamento de Ciências e Engenharia do Ambiente, Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa, 2829–516 Caparica, Portugal 3Departamento de Ciências e Tecnologia, Universidade Aberta, Rua da Escola Politécnica, 141, 1269–001 Lisboa, Portugal 4CENSE — Centre for Environmental and Sustainability Research, Departamento de Ciências e Engenharia do Ambiente, Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa, 2829–516 Caparica, Portugal m.joao.silva@insa.min-saude.pt  *Baseado na publicação Pinto M, Costa PM, Louro H, Costa MH, Lavinha J, Caeiro S, Silva MJ. Determining oxidative and non-oxidative genotoxic effects driven by estuarine sediment contaminants on a human hepatoma cell line. Science of the Total Environment 2014, 478, 25–35.  Introdução  O Estuário do rio Sado (Sudoeste Portugal) é o segundo maior do país e caracteriza-se por ter um grande valor ecológico e económico (Fig. 1). Apesar de ter vindo a ser afetado ao longo dos anos por várias fontes de poluição de origem urbana, industrial e agrícola, ainda continua a ser, para a população local, um local privilegiado para atividades piscícolas e agrícolas. A margem Norte é caraterizada por uma vasta zona urbana e industrial, localizada em torno da cidade de Setúbal; a margem Sul é bem conhecida pela presença de pequenas aldeias cuja população se ocupa, essencialmente, em práticas de pesca no estuário e de pequena agricultura, para além da existência da península de Troia, zona de alto valor turístico(1). Estudos anteriores revelaram a existência de diversas classes de contaminantes nos sedimentos deste estuário, incluindo metais, pesticidas e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs), cujos efeitos adversos em organismos vivos são conhecidos e já foram observados neste ambiente(2). Destes conhecimentos prévios surgiu uma preocupação relacionada com a potencial bioacumulação de contaminantes nas partes edíveis de espécies estuarinas, ou de produtos agrícolas de origem local, que poderiam entrar assim na cadeia alimentar humana e representar um problema de saúde pública. Neste contexto, o estudo da toxicidade ao nível genético - tal como a formação de quebras e/ou danos oxidativos no DNA ou de alterações cromossómicas - em modelos celulares ou animais, assumiu-se como particularmente relevante para a caraterização do potencial efeito nocivo dos contaminantes presentes nas águas e nos sedimentos estuarinos. Atualmente, de entre os biomarcadores de um efeito biológico (p.ex., de genotoxicidade) disponíveis, o ensaio do micronúcleo(3) e o ensaio do cometa(4) são os mais utilizados.   Fig. 1 – Mapa da área de estudo, o Estuário do Sado, com indicação dos diferentes locais de amostragem utilizados neste trabalho (N1, N2, S1, S2 e R).   Objetivos   O presente estudo integra-se num projeto mais amplo que visa avaliar o risco ambiental – que inclui os riscos ecológicos e para a saúde humana - associado a este ambiente estuarino contaminado. Em particular, este estudo teve como objetivo caracterizar o potencial citotóxico e genotóxico de sedimentos colhidos em vários locais de pesca do Estuário do Sado numa linha celular humana, tendo em vista uma avaliação de eventuais efeitos nefastos para a saúde humana.  Material e métodos   As amostras de sedimentos foram colhidas em 5 locais de pesca distintos do Estuário do Sado: amostras N1 e N2 na margem Norte (urbana/industrial(, amostras S1 e S2 na margem Sul (agrícola) e uma amostra de referência R colhida num banco de areia (Fig. 1). As amostras foram previamente caracterizadas para contaminantes orgânicos e inorgânicos(5,6). Para ensaios celulares, os contaminantes foram extraídos com uma mistura de diclorometano:metanol e recuperados em dimetilsulfóxido (DMSO). Os efeitos citotóxicos e genotóxicos dos extratos finais foram avaliados na linha celular derivada de um hepatoma humano HepG2 através do ensaio do vermelho neutro e dos ensaios do cometa [modificado com formamido-pirimidina-DNA glicosilase (FPG), para revelar danos oxidativos no DNA] e micronúcleo, respetivamente, após uma exposição de 48h a diferentes concentrações de extratos de sedimento [de 10 até 200 mg sedimento equivalente (SEQ)/mL de meio de cultura]  Resultados Os resultados dos diferentes ensaios encontram-se apresentados na Fig. 2. Após uma exposição de 48h, os extratos N1 e N2 induziram a maior redução na viabilidade de celular, até app. 91 e 85% de redução, respetivamente. Em contraste, os extratos S1 e S2 mostraram-se menos citotóxicos, com uma redução da viabilidade celular até app. 45%. A amostra de referência R não induziu citotoxicidade.  A análise dos resultados dos efeitos genotóxicos avaliados pelo ensaio do cometa, revelou a indução de quebras ao nível do DNA (sem FPG) e de danos oxidativos no DNA (com FPG), após a exposição a todos os extratos exceto o R. No geral, os níveis de danos não-oxidativos foram mais elevados em células expostas aos extratos de sedimentos da área Norte do estuário, enquanto que os níveis de danos oxidativos no DNA foram mais elevados após exposição aos extratos da área Sul. Isto é, as amostras N1 e N2 induziram um aumento significativo da percentagem de DNA na cauda, sem tratamento com FPG, às concentração testadas mais elevadas, em comparação com o controlo de solvente. No entanto, as amostras S1 e S2 induziram sobretudo danos oxidativos no DNA, sendo que o valor de percentagem de DNA na cauda, aquando tratamento com FPG, foi 6 vezes superior ao observado sem FPG. Todas amostras contaminadas induziram também um aumento significativo do número de células binucleadas micronucleadas (CBMN), dependente da concentração, revelando um potencial de induzir danos ao nível cromossómico. As amostras N1 e N2 aumentaram a frequência de CBMN em cerca de. 4 a 6 vezes, respetivamente, a 200 mg SEQ/mL, quando comparado com o controlo de solvente. Em contraste as amostras S2 e S1 produziram um aumento significativo da frequência de CBMN app. 3 a 4 vezes superior ao controlo de solvente, respetivamente, à concentração testada mais elevada.   Fig. 2 – Resultados dos ensaios do vermelho neutro (A), micronúcleos (B), cometa (C) e cometa modificado com FPG (D) em células HepG2, após uma exposição de 48 h aos diferentes extratos de sedimentos (10 a 200 mg SEQ/mL). Os resultados apresentados são o valor médio (±EP) de 3 experiências independentes (para A, C e D), e o valor médio (±DP) (para B). A concentração de 0 mg SEQ/mL corresponde ao controlo de solvente (DMSO a 2%, com exceção da amostra N1 no ensaio do cometa que corresponde a 0,5%). CBMN – Célula binucleada micronucleada; * - Diferenças estatisticamente significativas quando comparado com o respetivo controlo.  Discussão  Os resultados sugerem que existe uma diferença ao nível do potencial genotóxico dos sedimentos do estuário do Sado, dado que as amostras colhidas na margem Norte do estuário (N1 e N2) exibem valores mais elevados de indução de quebras de DNA e de micronúcleos do que as amostras colhidas na margem Sul do estuário (S1 e S2) que exibem, sobretudo, valores mais elevados de danos oxidativos de DNA. Conjuntamente com a análise de contaminantes dos sedimentos(5,6), sugere-se que os resultados obtidos para as amostras N1 e N2 serão principalmente devidos à presença de um nível mais elevado de contaminantes orgânicos, tais como HAPs, pesticidas ou bisfenilos policlorados, enquanto os resultados obtidos para as amostras S1 e S2 se deverão à predominância de contaminantes de origem inorgânica (metais e metaloides). No que diz respeito à amostra R, a falha na indução tanto de citotoxicidade como de genotoxicidade, nos diferentes ensaios, encontra-se concordante com os valores muito baixos de contaminação observados, confirmando ser uma boa área de referência(6). Assim, apesar do estuário ter sido classificado como moderadamente contaminado, com base apenas na caracterização dos contaminantes dos sedimentos, o presente estudo revela que a mistura desses mesmos contaminantes é capaz de induzir citotoxicidade e genotoxicidade, dependente da concentração, numa linha celular humana. Para além disso, os efeitos observados tiveram também um poder discriminatório capaz de distinguir duas áreas ecogeográficas distintas, a urbana/industrial e a rural/agrícola.  Conclusões  Os resultados obtidos sugerem que células HepG2 expostas a contaminantes da área Norte (urbana/industrial) apresentam os danos genotóxicos mais permanentes, refletidos na forte indução de micronúcleos. Em contraste, a exposição a extratos da área Sul (agrícola) resultou, particularmente, na indução de danos oxidativos no DNA. Estes resultados são concordantes tanto com os níveis e natureza da contaminação observada, como com os efeitos genotóxicos dos sedimentos previamente demonstrados in vivo, em espécies estuarinas.  Este estudo revelou que os resultados integrados dos indicadores de citotoxicidade, genotoxicidade e stress oxidativo obtidos em linhas celulares humanas expostas às misturas de contaminantes sedimentares, poderão constituir uma linha de evidência valiosa para a avaliação do risco para a saúde humana decorrente da exposição a um ambiente estuarino (moderadamente) contaminado.     Referências  (1) Caeiro S, Costa MH, Ramos TB, Fernandes F, Silveira N, Coimbra A, et al. Assessing heavy metal contamination in Sado Estuary sediment: an index analysis approach. Ecol Indic 2005;5:151–69.   (2) Costa PM, Caeiro S, Vale C, Delvalls T, Costa MH. Can the integration of multiple biomarkers and sediment geochemistry aid solving the complexity of sediment risk assessment? a case study with a benthic fish. Environ Pollut 2012;161:107–20.  (3) Fenech M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nat Protoc 2007;2:1084–104.   (4) Collins AR. Investigating Oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res 2009;681:24–32.  (5) Costa PM, Neuparth TS, Caeiro S, Lobo J, Martins M, Ferreira AM, et al. Assessment of the genotoxic potential of contaminated estuarine sediments in fish peripheral blood: laboratory versus in situ studies.  Environ Res 2010;111:25–36.  (6) Carreira S, Costa PM, Martins M, Lobo J, Costa MH, Caeiro S. Ecotoxicological heterogeneity in transitional coastal habitats assessed through the integration of biomarkers and sediment–contamination profiles: a case study using a commercial clam. Arch Environ Contam Toxicol 2013;64:97–109.    

Avaliação do potencial citotóxico e genotóxico de contaminantes de sedimentos do Estuário do Sado numa linha celular humana

The Repositório Aberto

Titulo 
Avaliação do potencial citotóxico e genotóxico de contaminantes de sedimentos do Estuário do Sado 
numa linha celular humana* 
Autores 
Miguel Pinto1, Pedro Manuel Costa 1,2, Henriqueta Louro1, Maria Helena Costa2, João Lavinha1, Sandra 
Caeiro2,3,4, Maria João Silva1 
1Departamento de Genética Humana, Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge, I.P., Av. Padre Cruz, 
1649–016 Lisboa, Portugal 
2IMAR — Instituto do Mar, Departamento de Ciências e Engenharia do Ambiente, Faculdade de Ciências 
e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa, 2829–516 Caparica, Portugal 
3Departamento de Ciências e Tecnologia, Universidade Aberta, Rua da Escola Politécnica, 141, 1269–
001 Lisboa, Portugal 
4CENSE — Centre for Environmental and Sustainability Research, Departamento de Ciências e 
Engenharia do Ambiente, Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa, 2829–
516 Caparica, Portugal 
m.joao.silva@insa.min-saude.pt 
 
*Baseado na publicação Pinto M, Costa PM, Louro H, Costa MH, Lavinha J, Caeiro S, Silva MJ. 
Determining oxidative and non-oxidative genotoxic effects driven by estuarine sediment contaminants on 
a human hepatoma cell line. Science of the Total Environment 2014, 478, 25–35. 
 
Introdução 
 
O Estuário do rio Sado (Sudoeste Portugal) é o segundo maior do país e caracteriza-se por ter um 
grande valor ecológico e económico (Fig. 1). Apesar de ter vindo a ser afetado ao longo dos anos por 
várias fontes de poluição de origem urbana, industrial e agrícola, ainda continua a ser, para a população 
local, um local privilegiado para atividades piscícolas e agrícolas. A margem Norte é caraterizada por 
uma vasta zona urbana e industrial, localizada em torno da cidade de Setúbal; a margem Sul é bem 
conhecida pela presença de pequenas aldeias cuja população se ocupa, essencialmente, em práticas de 
pesca no estuário e de pequena agricultura, para além da existência da península de Troia, zona de alto 
valor turístico(1). Estudos anteriores revelaram a existência de diversas classes de contaminantes nos 
sedimentos deste estuário, incluindo metais, pesticidas e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs), 
cujos efeitos adversos em organismos vivos são conhecidos e já foram observados neste ambiente(2). 
Destes conhecimentos prévios surgiu uma preocupação relacionada com a potencial bioacumulação de 
contaminantes nas partes edíveis de espécies estuarinas, ou de produtos agrícolas de origem local, que 
poderiam entrar assim na cadeia alimentar humana e representar um problema de saúde pública. Neste 
contexto, o estudo da toxicidade ao nível genético - tal como a formação de quebras e/ou danos 
oxidativos no DNA ou de alterações cromossómicas - em modelos celulares ou animais, assumiu-se como 
particularmente relevante para a caraterização do potencial efeito nocivo dos contaminantes presentes nas 
águas e nos sedimentos estuarinos. Atualmente, de entre os biomarcadores de um efeito biológico (p.ex., 
de genotoxicidade) disponíveis, o ensaio do micronúcleo(3) e o ensaio do cometa(4) são os mais utilizados.  
 
Fig. 1 – Mapa da área de estudo, o Estuário do Sado, com indicação dos diferentes locais de amostragem utilizados neste trabalho 
(N1, N2, S1, S2 e R).  
 
Objetivos 
 
 O presente estudo integra-se num projeto mais amplo que visa avaliar o risco ambiental – que 
inclui os riscos ecológicos e para a saúde humana - associado a este ambiente estuarino contaminado. Em 
particular, este estudo teve como objetivo caracterizar o potencial citotóxico e genotóxico de sedimentos 
colhidos em vários locais de pesca do Estuário do Sado numa linha celular humana, tendo em vista uma 
avaliação de eventuais efeitos nefastos para a saúde humana. 
 
Material e métodos 
 
 As amostras de sedimentos foram colhidas em 5 locais de pesca distintos do Estuário do Sado: 
amostras N1 e N2 na margem Norte (urbana/industrial(, amostras S1 e S2 na margem Sul (agrícola) e uma 
amostra de referência R colhida num banco de areia (Fig. 1). As amostras foram previamente 
caracterizadas para contaminantes orgânicos e inorgânicos(5,6). Para ensaios celulares, os contaminantes 
foram extraídos com uma mistura de diclorometano:metanol e recuperados em dimetilsulfóxido (DMSO). 
Os efeitos citotóxicos e genotóxicos dos extratos finais foram avaliados na linha celular derivada de um 
hepatoma humano HepG2 através do ensaio do vermelho neutro e dos ensaios do cometa [modificado 
com formamido-pirimidina-DNA glicosilase (FPG), para revelar danos oxidativos no DNA] e 
micronúcleo, respetivamente, após uma exposição de 48h a diferentes concentrações de extratos de 
sedimento [de 10 até 200 mg sedimento equivalente (SEQ)/mL de meio de cultura] 
 
Resultados 
Os resultados dos diferentes ensaios encontram-se apresentados na Fig. 2. Após uma exposição 
de 48h, os extratos N1 e N2 induziram a maior redução na viabilidade de celular, até app. 91 e 85% de 
redução, respetivamente. Em contraste, os extratos S1 e S2 mostraram-se menos citotóxicos, com uma 
redução da viabilidade celular até app. 45%. A amostra de referência R não induziu citotoxicidade.  
A análise dos resultados dos efeitos genotóxicos avaliados pelo ensaio do cometa, revelou a 
indução de quebras ao nível do DNA (sem FPG) e de danos oxidativos no DNA (com FPG), após a 
exposição a todos os extratos exceto o R. No geral, os níveis de danos não-oxidativos foram mais 
elevados em células expostas aos extratos de sedimentos da área Norte do estuário, enquanto que os 
níveis de danos oxidativos no DNA foram mais elevados após exposição aos extratos da área Sul. Isto é, 
as amostras N1 e N2 induziram um aumento significativo da percentagem de DNA na cauda, sem 
tratamento com FPG, às concentração testadas mais elevadas, em comparação com o controlo de 
solvente. No entanto, as amostras S1 e S2 induziram sobretudo danos oxidativos no DNA, sendo que o 
valor de percentagem de DNA na cauda, aquando tratamento com FPG, foi 6 vezes superior ao observado 
sem FPG. Todas amostras contaminadas induziram também um aumento significativo do número de 
células binucleadas micronucleadas (CBMN), dependente da concentração, revelando um potencial de 
induzir danos ao nível cromossómico. As amostras N1 e N2 aumentaram a frequência de CBMN em cerca 
de. 4 a 6 vezes, respetivamente, a 200 mg SEQ/mL, quando comparado com o controlo de solvente. Em 
contraste as amostras S2 e S1 produziram um aumento significativo da frequência de CBMN app. 3 a 4 
vezes superior ao controlo de solvente, respetivamente, à concentração testada mais elevada.  
 Fig. 2 – Resultados dos ensaios do vermelho neutro (A), micronúcleos (B), cometa (C) e cometa modificado com FPG (D) em 
células HepG2, após uma exposição de 48 h aos diferentes extratos de sedimentos (10 a 200 mg SEQ/mL). Os resultados 
apresentados são o valor médio (±EP) de 3 experiências independentes (para A, C e D), e o valor médio (±DP) (para B). A 
concentração de 0 mg SEQ/mL corresponde ao controlo de solvente (DMSO a 2%, com exceção da amostra N1 no ensaio do cometa 
que corresponde a 0,5%). CBMN – Célula binucleada micronucleada; * - Diferenças estatisticamente significativas quando 
comparado com o respetivo controlo. 
 
Discussão 
 
Os resultados sugerem que existe uma diferença ao nível do potencial genotóxico dos sedimentos 
do estuário do Sado, dado que as amostras colhidas na margem Norte do estuário (N1 e N2) exibem 
valores mais elevados de indução de quebras de DNA e de micronúcleos do que as amostras colhidas na 
margem Sul do estuário (S1 e S2) que exibem, sobretudo, valores mais elevados de danos oxidativos de 
DNA. Conjuntamente com a análise de contaminantes dos sedimentos(5,6), sugere-se que os resultados 
obtidos para as amostras N1 e N2 serão principalmente devidos à presença de um nível mais elevado de 
contaminantes orgânicos, tais como HAPs, pesticidas ou bisfenilos policlorados, enquanto os resultados 
obtidos para as amostras S1 e S2 se deverão à predominância de contaminantes de origem inorgânica 
(metais e metaloides). No que diz respeito à amostra R, a falha na indução tanto de citotoxicidade como 
de genotoxicidade, nos diferentes ensaios, encontra-se concordante com os valores muito baixos de 
contaminação observados, confirmando ser uma boa área de referência(6). Assim, apesar do estuário ter 
sido classificado como moderadamente contaminado, com base apenas na caracterização dos 
contaminantes dos sedimentos, o presente estudo revela que a mistura desses mesmos contaminantes é 
capaz de induzir citotoxicidade e genotoxicidade, dependente da concentração, numa linha celular 
humana. Para além disso, os efeitos observados tiveram também um poder discriminatório capaz de 
distinguir duas áreas ecogeográficas distintas, a urbana/industrial e a rural/agrícola. 
 
Conclusões 
 
Os resultados obtidos sugerem que células HepG2 expostas a contaminantes da área Norte 
(urbana/industrial) apresentam os danos genotóxicos mais permanentes, refletidos na forte indução de 
micronúcleos. Em contraste, a exposição a extratos da área Sul (agrícola) resultou, particularmente, na 
indução de danos oxidativos no DNA. Estes resultados são concordantes tanto com os níveis e natureza 
da contaminação observada, como com os efeitos genotóxicos dos sedimentos previamente demonstrados 
in vivo, em espécies estuarinas.  
Este estudo revelou que os resultados integrados dos indicadores de citotoxicidade, 
genotoxicidade e stress oxidativo obtidos em linhas celulares humanas expostas às misturas de 
contaminantes sedimentares, poderão constituir uma linha de evidência valiosa para a avaliação do risco 
para a saúde humana decorrente da exposição a um ambiente estuarino (moderadamente) contaminado.    
 
Referências 
 
(1) Caeiro S, Costa MH, Ramos TB, Fernandes F, Silveira N, Coimbra A, et al. Assessing heavy metal 
contamination in Sado Estuary sediment: an index analysis approach. Ecol Indic 2005;5:151–69.  
 
(2) Costa PM, Caeiro S, Vale C, Delvalls T, Costa MH. Can the integration of multiple biomarkers and 
sediment geochemistry aid solving the complexity of sediment risk assessment? a case study with a 
benthic fish. Environ Pollut 2012;161:107–20. 
 
(3) Fenech M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nat Protoc 2007;2:1084–104.  
 
(4) Collins AR. Investigating Oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res 
2009;681:24–32. 
 
(5) Costa PM, Neuparth TS, Caeiro S, Lobo J, Martins M, Ferreira AM, et al. Assessment of the 
genotoxic potential of contaminated estuarine sediments in fish peripheral blood: laboratory versus in situ 
studies.  Environ Res 2010;111:25–36. 
 
(6) Carreira S, Costa PM, Martins M, Lobo J, Costa MH, Caeiro S. Ecotoxicological heterogeneity in 
transitional coastal habitats assessed through the integration of biomarkers and sediment–contamination 
profiles: a case study using a commercial clam. Arch Environ Contam Toxicol 2013;64:97–109. 
 
 
 


Portuguese

O presente estudo integra-se num projeto mais amplo que visa avaliar o risco ambiental – que inclui os riscos ecológicos e para a saúde humana - associado a este ambiente estuarino contaminado.
 Em particular, este estudo teve como objetivo caracterizar o potencial citotóxico e genotóxico de sedimentos colhidos em vários
 locais de pesca do Estuário do Sado numa linha celular humana, tendo em vista uma avaliação de eventuais efeitos nefastos para a saúde humana.Estudo financiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia, através do financiamento plurianual PEst-OE/SAU/UI0009/2011 e do projeto
PTDC/SAU-ESA/100107/2008

Costa, Pedro Manuel

Scientific Repository of the National Health Institute Doutor Ricardo Jorge

Repositório Científico do Instituto Nacional de Saúde

_Avaliação do potencial citotóxico e genotóxico de contaminantes de sedimentos do Estuário do Sado numa linha celular humana  Miguel Pinto1, Pedro Manuel Costa1,2, Henriqueta Louro1, Maria Helena Costa 2, João Lavinha1, Sandra Caeiro 2,3,4, Maria João Silva1 m.joao.silva@insa.min-saude.pt(1) Unidade de Investigação e Desenvolvimento. Departamento de Genética Humana, INSA.(2) Instituto do Mar, Departamento de Ciências e Engenharia do Ambiente, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa.(3) Departamento de Ciências e Tecnologia, Universidade Aberta.(4) Centro de Investigação em Ambiente e Sustentabi l idade, Depar tamento de Ciências e Engenhar ia do Ambiente, Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa._IntroduçãoO Estuário do rio Sado (sudoeste de Portugal) é o segundo maior do país e caracteriza-se por ter um grande valor ecológico e eco-nómico (figura 1). Apesar de ter vindo a ser afetado ao longo dos anos por várias fontes de poluição de origem urbana, industrial e agrícola, ainda continua a ser, para a população local, um lugar pri-vilegiado para atividades piscícolas e agrícolas. A margem norte é caraterizada por uma vasta zona urbana e industrial, localizada em torno da cidade de Setúbal; a margem sul é conhecida pela presen-ça de pequenas aldeias cuja população se ocupa, essencialmen-te, em práticas de pesca no estuário e de pequena agricultura, para além da existência da península de Troia, zona de alto valor turísti-co (1). Estudos anteriores revelaram a existência de diversas classes de contaminantes nos sedimentos deste estuário, incluindo metais, pesticidas e hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs), cujos efeitos adversos em organismos vivos são conhecidos e já foram observados neste ambiente (2). Destes conhecimentos prévios surgiu uma preocupação relacionada com a potencial bioacumula-ção de contaminantes nas partes edíveis de espécies estuarinas, ou de produtos agrícolas de origem local, que poderiam entrar assim na cadeia alimentar humana e representar um problema de saúde pública. Neste contexto, o estudo da toxicidade ao nível ge-nético - tal como a formação de quebras e/ou danos oxidativos no DNA ou de alterações cromossómicas - em modelos celulares ou animais, assumiu-se como particularmente relevante para a ca-raterização do potencial efeito nocivo dos contaminantes presen-tes nas águas e nos sedimentos estuarinos. Atualmente, de entre os biomarcadores de um efeito biológico (p.ex., de um efeito ge-notóxico) disponíveis, o ensaio do micronúcleo (3) e o ensaio do cometa (4) são os mais utilizados.artigos breves_  n. 6 _Fatores de Risco em Ambientes Hídricos SetúbalPortoParque industrialOceanoAtlânticoRio SadoArrozaisCarrasqueira1kmÁrea do estaleiroCanal deÁguas de MouraPenínsulade TroiaSetúbalCanal deAlcácerN1N2S2S1RLisboaFigura 1:      Mapa da área de estudo, o Estuário do Sado, com indicação dos diferentes locais de amostragem utilizados neste trabalho (N1, N2, S1, S2 e R). 18especial 420142ª sérienúmero:Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.pt_ObjetivosO presente estudo integra-se num projeto mais amplo que visa avaliar o risco ambiental – que inclui os riscos ecológicos e para a saúde humana - associado a este ambiente estuarino contamina-do. Em particular, este estudo teve como objetivo caracterizar o potencial citotóxico e genotóxico de sedimentos colhidos em vários locais de pesca do Estuário do Sado numa linha celular humana, tendo em vista uma avaliação de eventuais efeitos nefastos para a saúde humana._Material e métodosAs amostras de sedimentos foram colhidas em 5 locais de pesca distintos do Estuário do Sado: amostras N1 e N2 na margem norte (urbana/industrial), amostras S1 e S2 na margem sul (agrícola) e uma amostra de referência R colhida num banco de areia (figura 1). As amostras foram previamente caracterizadas para contaminantes orgânicos e inorgânicos (5,6). Para ensaios celulares, os contami-nantes foram extraídos com uma mistura de diclorometano:metanol e recuperados em dimetilsulfóxido (DMSO). Os efeitos citotóxicos e genotóxicos dos extratos finais foram avaliados na linha celular derivada de um hepatoma humano HepG2, através do ensaio do vermelho neutro e dos ensaios do cometa [modificado com forma-mido-pirimidina-DNA glicosilase (FPG), para revelar danos oxidati-vos no DNA] e micronúcleo, respetivamente, após uma exposição de 48 h a diferentes concentrações de extratos de sedimento [de 10 até 200 mg sedimento equivalente (SEQ)/mL de meio de cultu-ra]._ResultadosOs resultados dos diferentes ensaios encontram-se apresentados no gráfico 1A-D. Após uma exposição de 48 h, os extratos N1 e N2 induziram a maior redução na viabilidade celular, até app. 91 e 85% de redução, respetivamente. Em contraste, os extratos S1 e S2 mostraram-se menos citotóxicos, com uma redução da viabili-dade celular até app. 45%. A amostra de referência R não induziu citotoxicidade. A análise dos resultados dos efeitos genotóxicos, avaliados pelo ensaio do cometa, revelou a indução de quebras ao nível do DNA (sem FPG) e de danos oxidativos no DNA (com FPG), após a expo-sição a todos os extratos, exceto o R. No geral, os níveis de danos não-oxidativos foram mais elevados em células expostas aos ex-tratos de sedimentos da área norte do estuário, enquanto os níveis de danos oxidativos no DNA foram mais elevados após exposição aos extratos da área sul. Isto é, as amostras N1 e N2 induziram um aumento significativo da percentagem de DNA na cauda, sem tra-tamento com FPG, às concentração testadas mais elevadas, em comparação com o controlo de solvente. No entanto, as amostras S1 e S2 induziram sobretudo danos oxidativos no DNA, sendo que o valor de percentagem de DNA na cauda, aquando do tratamen-to com FPG, foi 6 vezes superior ao observado sem FPG. Todas as amostras contaminadas induziram também um aumento signifi-cativo do número de células binucleadas micronucleadas (CBMN), dependente da concentração, revelando um potencial de induzir danos ao nível cromossómico (gráfico 1B). As amostras N1 e N2 causaram um aumento da frequência de CBMN em cerca de 4 a 6 vezes, respetivamente, a 200 mg SEQ/mL, quando comparada à do controlo de solvente. Em contraste as amostras S2 e S1 produ-ziram um aumento significativo da frequência de CBMN app. 3 a 4 vezes superior ao controlo de solvente, respetivamente, à concen-tração testada mais elevada._DiscussãoOs resultados sugerem que existe uma diferença ao nível do poten-cial genotóxico dos sedimentos do estuário do Sado, dado que as amostras colhidas na margem norte do estuário (N1 e N2) exibem valores mais elevados de indução de quebras de DNA e de micro-núcleos do que as amostras colhidas na margem sul do estuário (S1 e S2) que exibem, sobretudo, valores mais elevados de danos oxidativos de DNA. Conjuntamente com a análise de contaminan-tes dos sedimentos (5,6), sugere-se que os resultados obtidos para as amostras N1 e N2 serão principalmente devidos à presença de um nível mais elevado de contaminantes orgânicos, tais como HAPs, pesticidas ou bisfenilos policlorados, enquanto os resulta-dos obtidos para as amostras S1 e S2 se deverão à predominân-cia de contaminantes de origem inorgânica (metais e metaloides). No que diz respeito à amostra R, a falha na indução tanto de citotoxici-dade como de genotoxicidade, nos diferentes ensaios, encontra-se concordante com os valores muito baixos de contaminação observa-dos, confirmando ser uma boa área de referência (6). Assim, apesar artigos breves_  n. 619especial 420142ª sérienúmero:Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.ptartigos breves_   n. 620Gráfico 1A-D:      Resultados dos ensaios do vermelho neutro (A), micronúcleos (B), cometa (C) e cometa modificado com FPG   (D) em células HepG2, após uma exposição de 48 h aos diferentes extratos de sedimentos (10 a 200 mg SEQ/mL). Os resultados apresentados são o valor médio (±EP) de 3 experiências independentes (para A, C e D), e o valor médio (±DP) (para B). A concentração de 0 mg SEQ/mL corresponde ao controlo de solvente (DMSO a 2%, com exceção da amostra N1 no ensaio do cometa que corresponde a 0,5%). CBMN– Célula binucleada micronucleada;  - Diferenças estatisticamente signif icativas quando comparado com o respetivo controlo. No gráfico 1C e 1D, para as amostras N1 e N2, as concentrações mais elevadas não foram testadas devido à elevada citotoxicidade observada nestas condições.020406080100120% de viabilidadeConcentração (mg SEQ/mL)05101520253035Média da % de DNA na caudaConcentração (mg SEQ/mL) Concentração (mg SEQ/mL)01020304050607080900 10 25 50 100 200Média de CBMN por 1000 CBConcentração (mg SEQ/mL)0 10 25 50 100 2000 10 25 50 100 20005101520253035Média da % de DNA na cauda0 10 25 50 100 200A BC DAmostra R Amostra S1 Amostra S2 Amostra N1 Amostra N2especial 420142ª sérienúmero:Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.ptartigos breves_   n. 6do estuário ter sido classificado como moderadamente contamina-do, com base apenas na caracterização dos contaminantes dos se-dimentos, o presente estudo revela que a mistura desses mesmos contaminantes é capaz de induzir citotoxicidade e genotoxicida-de, dependente da concentração, numa linha celular humana. Para além disso, os efeitos observados tiveram também um poder dis-criminatório capaz de distinguir duas áreas ecogeográficas distin-tas, a urbana/industrial e a rural/agrícola._ConclusõesOs resultados obtidos sugerem que células HepG2 expostas a contaminantes da área norte (urbana/industrial) apresentam os danos genotóxicos mais permanentes, refletidos na forte indução de micronúcleos. Em contraste, a exposição a extratos da área sul (agrícola) resultou, particularmente, na indução de danos oxi-dativos no DNA. Estes resultados são concordantes tanto com os níveis e natureza da contaminação observada, como com os efeitos genotóxicos dos sedimentos previamente demonstrados in vivo, em espécies estuarinas (2). Este estudo revelou que os resultados integrados dos indicadores de citotoxicidade, genotoxicidade e stress oxidativo obtidos em linhas celulares humanas expostas às misturas de contaminantes sedimentares, poderão constituir uma linha de evidência valiosa para a identificação e avaliação do risco para a saúde humana de-corrente da exposição a um ambiente estuarino classificado qui-micamente como moderadamente contaminado.   AgradecimentosEste estudo foi financiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia, atra-vés do financiamento plurianual PEst-OE/SAU/UI0009/2011 e do projeto PTDC/SAU-ESA/100107/2008.21Referências bibliográficas:(1) Caeiro S, Costa MH, Ramos TB, et al. Assessing heavy metal contamination in Sado Estuary sediment: an index analysis approach. Ecol Indic 2005;5(2):151-69. (2) Costa PM, Caeiro S, Vale C, et al. Can the integration of multiple biomarkers and sediment geochemistry aid solving the complexity of sediment r isk assessment? a case study with a benthic f ish. Environ Pollut. 2012;161:107-20.(3) Fenech M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nat Protoc. 2007;2(5):1084-104. (4) Coll ins AR. Investigating Oxidative DNA damage and its repair using the comet assay. Mutat Res. 2009;681(1):24-32.(5) Costa PM, Neupar th TS, Caeiro S, et al. Assessment of the genotoxic potential of contaminated estuarine sediments in f ish peripheral blood: laboratory versus in situ studies.  Environ Res. 2010;111(1):25-36.(6) Carreira S, Costa PM, Martins M, et al. Ecotoxicological heterogeneity in transitional coastal habitats assessed through the integration of biomarkers and sediment–contamination prof i les: a case study using a commercial clam. Arch Environ Contam Toxicol. 2013;64(1):97-109.Artigo adaptado de: Pinto M, Costa PM, Louro H, et al. Determining oxidative and non-oxidative genotoxic ef fects driven by estuarine sediment contaminants on a human hepatoma cell l ine. Sci Total Environ. 2014;478:25-35. http://hdl.handle.net/10400.18/2316especial 420142ª sérienúmero:Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge, IPDoutor Ricardo JorgeNacional de Saúde_Instituto Observações_ Boletim Epidemiológicowww.insa.pt

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Avaliação do potencial citotóxico e genotóxico de contaminantes de sedimentos do Estuário do Sado numa linha celular humana

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