Ανάπτυξη Μεθόδου Υγρής Χρωματογραφίας Υψηλής Απόδοσης με Διαδοχική Φασματομετρία Μάζας Ιονισμού Ατμοσφαιρικής Πίεσης για τον Προσδιορισμό Σεληνοσακχάρων σε Ανθρώπινα Ούρα

Abstract

Το σελήνιο (Se) ως ιχνοστοιχείο απαραίτητο για την συντήρηση της ζωής παρουσιάζει σημαντικό ερευνητικό ενδιαφέρον. Διάφορες μελέτες έχουν γίνει με απώτερο σκοπό να κατανοηθεί καλύτερα η βιοχημική συμπεριφορά του. Προς επίτευξη αυτού του στόχου είναι ιδιαίτερα σημαντικός και ο χαρακτηρισμός των μεταβολιτών Se στα ούρα θηλαστικών. Στη παρούσα εργασία περιγράφεται η ανάπτυξη μεθόδων υγρής χρωματογραφίας υψηλής απόδοσης και διαδοχικής φασματομετρίας μάζας, δύο τύπων ιονισμού ατμοσφαιρικής πίεσης, για τον προσδιορισμό ιχνοποσοτήτων σεληνοσακχάρων στα ανθρώπινα ούρα. Τα σεληνοσάκχαρα για τα οποία γίνεται λόγος είναι τα εξής: 1- methylseleno-2-acetamido-1,2-dideoxy β-D-galactopyranoside (SeGalNAc), το διαστεροϊσομερές του 1-methylseleno-2-acetamido-1,2-dideoxy β-D-glucopyranoside (SeGluNAc) και το 1-methylseleno-1,2-dideoxy β-D-galactopyranoside (SeGalNΗ2). Παρακάτω δίνονται οι δομές των σεληνοσακχάρων που μελετήθηκαν στην παρούσα εργασία. Σχήμα 1.1 SeGalNAc Σχήμα 1.2 SeGluNAc Σχήμα 1.3 SeGalNH2 Πιο συγκεκριμένα περιγράφεται η ανάπτυξη μιας σειράς αναλυτικών μεθόδων κατάλληλων για εύκολο, γρήγορο και ακριβή προσδιορισμό ιχνοποσοτήτων σεληνοσακχάρων σε ακατέργαστα δείγματα ανθρώπινων ούρων. Επίσης, και η ανάπτυξη μεθόδων κατάλληλων για την ανίχνευση αγνώστων μορφών σεληνοσακχάρων. Η έννοια της «εύκολης και γρήγορης» τεχνικής συνδέεται με την ανάγκη τα βιολογικά δείγματα να μην υποβάλλονται σε εκτενή επεξεργασία προκειμένου να αναλυθούν. Η επίπονη και πολλές φορές χρονοβόρα διαδικασία της επεξεργασίας των βιολογικών δειγμάτων δεν οδηγεί πάντα σε ακριβή αποτελέσματα εφόσον είναι πιθανόν σε αρκετές περιπτώσεις να αλλοιώνεται η αρχική μορφή του μεταβολίτη. Επίσης, ο ακριβής προσδιορισμός ενώσεων Se με φασματομετρία μάζας είναι ιδιαίτερα εύκολος κυρίως λόγω της ανίχνευσης των πολλαπλών ισοτόπων του στοιχείου. Προς επίτευξη των παραπάνω στόχων ερευνήθηκαν οι δυνατότητες της διαδοχικής φασματομετρίας μάζας (tandem mass spectrometry: MS/MS) για την ανίχνευση των σεληνοσακχάρων με εφαρμογή διαφόρων συνδυαστικών σαρώσεων. Αναλυτικότερα, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της παρακολούθησης επιλεγμένων αντιδράσεων (selected reaction monitoring, SRM) για τον ευαίσθητο και επιλεκτικό προσδιορισμό των γνωστών σεληνοσακχάρων και κατόπιν η μέθοδος απώλειας ουδέτερων μορίων (neutral loss scan) σε μια προσπάθεια ανίχνευσης αγνώστων μορφών σεληνοσακχάρων. Επιπλέον, λόγω της ιδιαίτερα σύνθετης μήτρας ακατέργαστων ούρων και των φαινομένων καταστολής του σήματος που συνήθως προκαλεί εξετάσθηκαν δύο διαφορετικές πηγές ατμοσφαιρικού ιονισμού. Πιο συγκεκριμένα συγκρίθηκε το μέγεθος της παρατηρούμενης καταστολής σήματος κατά την ανάλυση ούρων με ηλεκτροψεκασμό και με χημικό ιονισμό σε ατμοσφαιρική πίεση. Αυτό πραγματοποιήθηκε με προσθήκη γνωστής ποσότητας των διαφόρων μορφών Se. Τέλος τα ποσοτικά αποτελέσματα της μεθόδου συγκρίθηκαν με αυτά της τεχνικής HPLC-ICP-MS