The aim of this project was to answer to the question if it is possible to create an in vitro culture system of human B lymphocytes that will be able to react with "self antigens" producing IgG antibodies with high specificity and affinity for the antigen. We are trying to mimic, with the best way, the array of events witch occurs inside the Germinal Centers during a natural humoral response. These events concern mainly the direct contact and interaction between the specific B and T cells witch signal the isotype switch and the induction of somatic mutations to Ig genes inducing their affinity maturation. The selected B cell antigen epitopes come, within synthetic procedures, from the well characterized VNTR regions of human mucins. These molecules show high levels οf glycosylation and they are normally expressed in the mucus epithelium of many tissues such as the intestine. Sometimes, many types of cancer cells from adeno-carcinomas are characterized by an increased number of these mucins with different or absent glycosylation. Thus, the exposure of their protein skeleton in the surface of cancer cells, due to defective glycosylation, make these regions good targets for immuno-therapy. This approach, with the in vitro immunization system, showed production of a specific antibody against the Muc3 peptide with low density. This IgG antibody, was tested by ELISA assay and FACs analysis and showed a great specific inhibition with the soluble Muc3 peptide, and a specific intracellular binding on intestinal cancer cell lines, respectively. It was also tested on formalin-fixed tissue sections from adeno-carcinomas samples, by immunoperoxidase staining, where was found specific dim binding reaction only on malignant intestinal sections.Βασικός στόχος αυτής της διατριβής ήταν μία απάντηση στο εάν μπορεί να στηθεί ένα in vitro σύστημα καλλιέργειας ανθρώπινων Β λεμφοκυττάρων ικανών να απαντούν σε αντιγόνα 'εαυτού' με την παραγωγή αντισωμάτων IgG ισοτύπου, υψηλής ειδικότητας και συγγένειας προς το αντιγόνο. Το σύστημα προσπαθήσαμε να το προσομοιάσουμε, κατά το βέλτιστο δυνατό τρόπο, με τη σειρά των γεγονότων που επιτελούνται μέσα στα βλαστικά κέντρα (Germinal centers) των δευτερογενών λεμφικών οργάνων κατά τη διάρκεια μιας φυσιολογικής χυμικής ανοσιακής απάντησης. Τα γεγονότα αυτά αφορούν κυρίως την άμεση επαφή και αλληλεπίδραση των ειδικών Β και Τ κυττάρων που σηματοδοτoύν την αλλαγή ισοτύπου και την επαγωγή σωματικών μεταλλαγών στα γονίδια των ανοσοσφαιρινών, προκαλώντας αύξηση της συγγένειας πρόσδεσής τους στα αντιγόνα (affinity maturation). Οι επιλεγμένοι για την ανοσοποίηση Β αντιγονικοί επίτοποι προήλθαν, μέσα από συνθετικές διαδικασίες, από τις καλά μέχρι σήμερα χαρακτηρισμένες VNTR περιοχές των ανθρώπινων βλεννινών. Αν και η εμφάνιση αυτών των μορίων θεωρείται φυσιολογική στα βλεννώδη επιθήλια πολλών ιστών (self antigens) όπως για παράδειγμα του εντέρου, σε πολλούς τύπους αδενο-καρκινωμάτων έχει σημειωθεί αύξηση της έκφρασής τους με παράλληλη αλλαγή, τροποποίηση ή ακόμα και απουσία της γλυκοζυλίωσής τους. Ως εκ τούτου, η έκθεση του πρωτεϊνικού σκελετού αυτών των μορίων, ως αποτέλεσμα της ελαττωματικής τους γλυκοζυλίωσης, τα κάνει αρκετά ευάλωτους στόχους για ανοσοθεραπεία. Η προσέγγιση αυτού του θέματος, μέσω του in vitro συστήματος ανοσοποίησης, έδωσε με χαμηλή, αλλά όχι αμελητέα συχνότητα, ειδικό αντίσωμα εναντίον του Muc3 πεπτιδίου. Το αντίσωμα αυτό, IgG ισοτύπου, ανέστειλε ειδικά το αντίστοιχο διαλυτό αντιγόνο, έδειξε με FACs ανάλυση ειδική ενδοκυτταρική χρώση σε καρκινικές σειρές παχέως εντέρου που εκφράζουν το παραπάνω πεπτίδιο, καθώς επίσης παρουσίασε και ασθενική αλλά ειδική πρόσδεση σε αντίστοιχα δείγματα καρκινικών ιστών (fomalin fixed sections) χρησιμοποιώντας ανοσοιστοχημικές μεθόδους
