Bramley, Peter M.

Fraser, Paul D.

Mora, Leticia

Sentandreu Vicente, Enrique

Sentandreu, Enrique

Repositorio Institucional de la Universidad de Córdoba

170 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52to remove high abundance proteins, like others used IRUKXPDQELRPDUNHULGHQWL¿FDWLRQWKH3URWHR0LQHUtreatment will decrease the amount of these high-abundance proteins. This kind of strategies should widen the number of applications in serum animal proteomics.This work was funded by grant AGL2006-02364/GAN from the Spanish “Ministerio de Edu-FDFLyQ\&LHQFLD´3DUWRIWKHIXQGLQJZDV¿QDQFHGby the FEDER program from the European Union. :HWKDQN0V$QQD9LODOWDIRUKHUH[FHOOHQWWHFKQL-cal assistance.References[1] Adkins JN, Varnum SM, Auberry KJ, Moore RJ, Angell NH, Smith RD et al. Toward a human blood serum proteome: analysis by multidimen-sional separation coupled with mass spectrome-try. Mol. Cell. Proteomics 2002; 1, 947-955.[2] Anderson NL and Anderson NG. The human plasma proteome: history, character, and diag-nostic prospects. Mol. Cell. Proteomics 2002; 1, 845-867.[3] Echan LA, Tang HY, Ali-Khan N, Lee K and 6SHLFKHU ':'HSOHWLRQ RIPXOWLSOH KLJKDEXQGDQFHSURWHLQVLPSURYHVSURWHLQSUR¿OLQJcapacities of human serum and plasma. Proteo-mics 2005; 5, 3292-3303.[4] Boschetti E and Righetti PG. The ProteoMiner in the proteomic arena: A non-depleting tool for discovering low-abundance species. J. Proteo-mics 2008; 71, 255-264.[5] Berkelman T and Stenstedt T. 2-D Electro-phoresis. Principles and methods. Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden. 1998.ResumenEn el presente trabajo se describe el desarrollo de un método para detectar la presencia de carne de pollo en mezclas de carne haciendo uso de la tecnología proteómica. Es un método simple y robusto que incluye una etapa de extracción de proteínas musculares, enriquecimiento de la pro-teína diana mediante isoelectroenfoque, digestión con tripsina de la misma y análisis de un péptido ELRPDUFDGRU HVSHFt¿FRV GH OD HVSHFLH DYLDUPH-diante LC-ESI-MS/MS. Esta metodología ha per-mitido detectar la presencia de un 0,5 % de carne de pollo contaminando carne de cerdo. Además de su sencillez, el método presenta la ventaja de poder aplicarse indistintamente al análisis de carne fresca y cocinada, representando una alternativa La Proteómica como vía para determinar el origen animal de los productos cárnicosMiguel Ángel Sentandreu1, Paul D. Fraser2, Enrique Sentandreu1, Leticia Mora1, Peter M. Bramley21 Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), P.O. Box 73, 46100 Burjassot, Valencia. España. 2 Center for Systems and Synthetic Biology, School of Biological  Sciences, Royal Holloway, 8QLYHUVLW\RI/RQGRQ(JKDP7:(;5HLQR8QLGRinteresante a los métodos que se están empleando actualmente para el control del origen animal de los productos cárnicos. Texto principalLos principales casos de adulteración en produc-tos cárnicos se relacionan con la sustitución de carne de elevada calidad por carne de un menor coste con REMHWR GH SRGHU REWHQHU XQ EHQH¿FLR HFRQyPLFRadicional. Para poder controlar el fraude que supo-ne esta forma de proceder es necesario disponer de métodos de análisis robustos, sensibles y precisos. De entre las tecnologías más empleadas hasta el momento para este propósito hay que destacar los inmunoensayos y los análisis de ADN. A pesar del 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 171gran avance que ha supuesto la introducción y el desarrollo de estas técnicas, existen importantes limitaciones cuando éstas se aplican al análisis de productos cárnicos procesados ya que las agresivas condiciones empleadas durante el procesado de la FDUQHSXHGHQLQÀXLUQHJDWLYDPHQWHHQHOUHFRQRFL-miento de las proteínas diana o del ADN [1]. Los recientes avances en las técnicas de espectrome-tría de masas aplicadas al campo de la proteómica constituyen una alternativa interesante a través de la LGHQWL¿FDFLyQGHSpSWLGRVELRPDUFDGRUHVHVSHFt¿FRVde cada especie animal. En el presente trabajo se ha VHOHFFLRQDGRXQSpSWLGRELRPDUFDGRUHVSHFt¿FRGHla especie aviar para poder detectar esta carne en cualquier tipo de mezcla de carne tanto fresca como cocinada. Para ello, un gramo de distintas mezclas de carne de pollo se homogeneizaron con 10 mL de tampón Tris, pH 8,0, centrifugándose a continuación durante 20 min a 10000 rpm. Se recogió el precipita-do obtenido y se solubilizó en el tampón Tris pH 8.0 conteniendo 6M de urea y 1 M de thiourea. Se tomo el volumen necesario de este extracto para fraccionar 2,5 mg de proteínas totales por isoelectroenfoque en el intervalo de pH 4-7 empleando un fraccionador OFFGEL 3100 (Agilent). De la fracción donde se localizó la cadena ligera de mosina 3 se tomaron 20 µL para realizar una digestión con tripsina. Después GH ODGLJHVWLyQVHDMXVWyHOYROXPHQ¿QDOGHFDGDmuestra a 30 µL, analizando los péptidos contenidos en este extracto mediante LC-ESI-MS/MS (Thermo (OHFWUyQ&RUS/D LGHQWL¿FDFLyQGH SpSWLGRV VHrealizó a partir de los espectros MS/MS empleando MASCOT como algoritmo y la base de datos de SURWHtQDV1&%,QU/D FXDQWL¿FDFLyQ GHO SpSWLGRseleccionado como biomarcador de la especie aviar en distintas mezclas de carne conteniendo diferentes porcentajes de carne de pollo se realizó mediante la adición de 5 picomoles del péptido seleccionado marcado con isótopos estables 13C6/15N (Técnica $48$/DLQWHJUDFLyQGHORVSLFRVFURPDWRJUi¿-cos correspondientes tanto al péptido nativo como al péptido pesado se realizó manualmente. La cantidad de péptido nativo en cada muestra  se determinó por comparación de las áreas de cada pico. El método que se ha desarrollado en el presente trabajo se esquematiza en la Figura 1. Las proteínas de los distintos extractos de carne se fraccionaron mediante isoelectroenfoque en medio líquido. En OD)LJXUD  VH SXHGHREVHUYDU HO SHU¿O GH SURWHt-nas obtenido en SDS-PAGE para las fracciones OFFGEL correspondientes a los valores de pH más ácidos. Como se puede apreciar, las fracciones 3 y 4 contienen una sola banda de proteína, corres-pondiente a la cadena ligera de miosina 3 (MLC3). (VWRFRQ¿UPDHOXVRGHOLVRHOHFWURHQIRTXHHQPHGLRlíquido como vía adecuada para el enriquecimiento de MLC3 como proteína diana para la posterior hidrólisis con tripsina y generación de péptidos po-Figura 2. SDS-PAGE al 12 % correspondiente a las nueve primeras fracciones obtenidas después de separar las pro-teínas de una mezcla de carne (1 % de pollo en carne de cerdo) con el fraccionador de proteínas en solución OFF-GEL 3100 de Agilent. El isoelectroenfoque se realizó en el intervalo de pH 4-7. Se indica la posición en el gel de la cadena ligera de miosina 3 (MLC3). Figura 1. Resumen esquemático del método desarrollado para detectar cuantitativamente la presencia de la carne de pollo en las distintas mezclas de carne. 172 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52ResumenEl objetivo principal de este trabajo se ha cen-trado en la generación de péptidos inhibidores de la Enzima Convertidora de Angiotensina I (ECA) después de la digestión de carne de cerdo mediante la acción secuencial de pepsina y pancreatina, si-mulando las condiciones del sistema digestivo. El hidrolizado fue analizado directamente mediante nanoLC-ESI-MS/MS, estudiando seguidamente las secuencias obtenidas a partir de los espectros MS/06/RVUHVXOWDGRVREWHQLGRVSRQHQGHPDQL¿HVWRel potencial de las proteínas de la carne de cerdo como fuente de péptidos antihipertensivos después de la digestión gastrointestinal.Péptidos inhibidores de la Enzima Convertidora de Angiotensina I generados en la digestión in vitro de la carne de cerdoElizabeth Escudero1, Miguel Angel Sentandreu1, Keizo Arihara2, Fidel Toldrá11Instituto de agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC). 2Faculty of Animal Science, School of Veterinary Medicine and Animal Sciences, Kitasato UniversityEstudios recientes han demostrado el potencial de la carne de cerdo al generar péptidos biologica-mente activos con capacidad para regular numero-sos procesos en el organismo [1], lo que otorga a la carne un valor añadido. En trabajos anteriores se han descrito péptidos con acción antioxidante, antimi-crobiana o antihipertensiva por ejemplo [2]. La ac-ción antihipertensiva ejercida por algunos péptidos es debida a su capacidad para inhibir la actividad ECA. En el presente estudio, se ha investigado la posibleactividad inhibidora de la ECA de los pépti-dos generados en  la digestión de las proteinas del músculo esquelético del cerdo por acción de las enzimas gastrointestinales. El proceso de digestión fue simulado in vitro usando pepsina y pancreatina tenciales biomarcadores de cada especie animal. El presente trabajo se ha centrado en la selección de un péptido biomarcador para detectar la presencia de pollo en mezclas de carne. Como criterios de selección se tuvo en cuenta que el péptido elegido IXHUDHVSHFt¿FRGH ODHVSHFLHDYLDUDVtFRPRTXHsu detección fuera posible aun en aquellos casos en los que la carne de pollo esté presente en bajas cantidades en el producto. De este modo, se llevó a cabo el protocolo de trabajo de la Figura 1 em-pleando una mezcla de carne conteniendo un 1% de pollo en carne de cerdo. Después de realizar la hidrólisis con tripsina de las fracciones OFFGEL 3 y 4 (Figura 2), el análisis mediante LC-ESI-MS/MS GHORVSpSWLGRVJHQHUDGRVSHUPLWLyODLGHQWL¿FDFLyQGHO SpSWLGRELRPDUFDGRU H VSHFt¿FRGH OD HVSHFLHaviar 37ALGQNPTNAEINK49 procedente de MLC3. /D FXDQWL¿FDFLyQ GH HVWH SpSWLGR HQPH]FODV GHcarne conteniendo distintos porcentajes de carne de pollo (0, 0,5, 1, 2, 5 y 10 %) se realizó mediante la adición de su homólogo marcado con isótopos estables (+7 Da)  al extracto enriquecido en MLC3 después del fraccionamiento en OFFGEL (Figura 1). De este modo se obtuvo una buena correlación lineal (R2 = 0,9921) entre el porcentaje de carne de pollo añadido a la mezcla y la cantidad del péptido biomarcador seleccionado, determinada por LC-ESI-MS/MS. El método desarrollado en el presente WUDEDMRHVSUHFLVR\VHQVLEOHDGHPiVGHVHU¿DEOHHQel análisis de alimentos sometidos a un tratamiento térmico elevado. Los resultados obtenidos permiten D¿UPDUTXHODDSUR[LPDFLyQSURWHyPLFDSXHGHVHUuna alternativa de interés a los métodos empleados actualmente para resolver el problema de la deter-minación de las especies cárnicas. Referencias>@ :RROIH03ULPURVH6)RRG IRUHQVLFVXVLQJDNA technology to combat misdescription and fraud. Trends in Biotechnology 2004; 22 (5): 222-6.

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