Barcos, Montserrat

Corrales, Fernando J.

Espejo, Isabel

López-Sánchez, Laura M.

Muñoz-Castañeda, Juan R.

Rodríguez-Ariza, Antonio

Repositorio Institucional de la Universidad de Córdoba

86 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52a gran escala. El examen manual de los espectros sería impensable, solo factible cuando estudiamos PRGL¿FDFLRQHVSDUDXQDSURWHtQD~QLFDQuizás, un mayor conocimiento del mecanismo de fragmentación de estos péptidos pueda dar lugar D XQDPHMRUD HQ OD LGHQWL¿FDFLyQ FRUUHFWD GH ORVmismos y, de esta forma, hacer posible el estudio de HVWDPRGL¿FDFLyQDQLYHOGHSURWHRPDReferencias[1] Dalle-Donne I, Rossi R, Giustarini D, Colombo R, Milzani A. “S-glutathionylation in protein UHGR[ UHJXODWLRQ´ )UHH 5DGLFDO %LRORJ\	Medicine 2007; 43:883-898.[2] Dalle-Donne I, Rossi R, Colombo G, Giustarini D, Milzani A. “Protein S-glutathionylation: a regulatory device from bacteria to humans”. Trends in Biochemical Sciences 2008; 34, 2:85-96.[3] Bonzon-Kulichenko E, Pérez-Hernández D, Núñez E, Martínez-Acedo P, Navarro P, Trevi-san-Herraz M, Ramos MC, Sierra S, Martínez-Martínez S, Ruiz-Meana M, Miró-Casas E, García-Dorado D, Redondo JM, Burgos JS, Vázquez J. “A robust method for quantitative high-throughput analysis of proteomes by 18O labeling”. Mol Cell Proteomics, 2009  (en revisión).>@ %RUJHV&5*HGGHV7-:DWVRQ -7.XKQD.M. “Dopamine biosynthesis is regulated by S-glutathionylation. Potential mechanism of tyrosine hydroxylase inhibition under oxidative stress”. J Biol Chem 2002; 277:48295-48302.IntroducciónLas intervenciones que faciliten el metabolismo del óxido nítrico (NO) en etapas colestásicas tempra-nas pueden ayudar a mantener el estado redox de las proteínas hepáticas. Además, escasos estudios han explorado la participación de la S-nitrosilación de proteínas y el metabolismo de nitrosotioles (SNO) en la lesión hepatocelular por colestasis. Metodología6HGLYLGLHURQUDWDVPDFKR:LVWDUJHQ4 grupos (n=10): operación simulada (OS), ligadura del conducto biliar (BDL), y ratas BDL tratadas con el inhibidor de síntesis de NO S-metilisotiourea La inhibición de la síntesis de óxido nítrico durante la colestasis inducida experimentalmente reduce la lesión hepatocelular al facilitar la homeostasis de nitrosotiolesLaura M. López-Sánchez1, Fernando J. Corrales2, Montserrat Barcos3, Isabel Espejo3, Juan R. Muñoz-Castañeda1, Antonio Rodríguez-Ariza11Hospital Universitario Reina Sofía. Unidad de Investigación, IMIBIC, Córdoba, 2Universidad de Navarra, Hepatology and Gene Therapy Unit, Pamplona, 3Hospital Universitario Reina Sofía. Servicio de Análisis Clínicos, Córdoba(SMT, 25 mg/Kg) o con ácido tauroursodeoxicólico (TUDCA, 50 mg/Kg). La función hepática y NO plasmático se analizaron mediante ensayos bioquí-micos. La proliferación ductular se determinó en cortes teñidos con hematoxilina-eosina y se con-¿UPyFRQ LQPXQRWLQFLyQ HVSHFt¿FD FLWRTXHUDWLQDGHFRODQJLRFLWRVPDGXURV/D¿EURVLVKHSiWLFDse determinó mediante tinción con tricrómico de Masson. Se analizó la expresión de la bomba ex-portadora de productos conjugados (Mrp2), afectada en diversos modelos experimentales de colestasis, mediante  western blot, y la de iNOS y la enzi-PDQLWURVRJOXWDWLyQUHGXFWDVD*6125FRGL¿FDGDpor el gen ADH5 en humanos) por RT-PCR. Las SURWHtQDV6QLWURVLODGDVVHGHWHFWDURQ\SXUL¿FDURQcon el método “biotin-switch”, una aproximación 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 87metodológica que permite el marcado selectivo de las nitrosoproteínas con biotina, en el que los tioles libres se bloquean con metil metanotiosulfonato, a continuación los SNO son reducidos selectivamente FRQ DVFRUEDWR\¿QDOPHQWH ORV WLROHV QXHYDPHQWHformados reaccionan con HPDP-biotina. Las pro-teínas biotiniladas se detectaron mediante un anti-FXHUSRDQWLELRWLQDRSXUL¿FDURQXWLOL]DQGRHVWUHS-WDYLGLQD\VHLGHQWL¿FDURQSRUDQiOLVLVSURWHyPLFRcon HPLC acoplado a ESI-MS/MS. ResultadosFigura 1. Marcadores séricos de función hepática en ratas BDL.Figura 2. Expresión de la proteína Mrp2 en ratas BDL. Después de 7 días, el inhibidor de iNOS fue mucho mas efectivo que TUDCA en reducir la le-sión hepatocelular, con una disminución de enzimas hepáticas y de bilirrubina circulantes (Figura 1) y XQJUDGRVLJQL¿FDWLYDPHQWHPHQRUGHSUROLIHUDFLyQGXFWXODU\¿EURVLVSHULSRUWDO>@$PERVWUDWDPLHQ-tos recuperaron los niveles basales del transportador canalicular Mrp2 cuya expresión se inhibe durante la colestasis (Figura 2), pero sólo el tratamiento FRQ607GLVPLQX\yVLJQL¿FDWLYDPHQWHORVHOHYDGRVniveles plasmáticos de NO y de proteínas hepáticas S-nitrosiladas en las ratas BDL (Figuras 3 y 4). La expresión de GSNOR hepática, que regula la ho-meostasis de SNO y los niveles de proteínas S-nitro-siladas, mostró un acusado descenso en ratas BDL, que se recuperó tras el tratamiento con SMT, pero no FRQ78'&$)LJXUD6HLGHQWL¿FDURQSURWHt-nas hepáticas que se encontraban S-nitrosiladas en ratas BDL (Tabla 1), incluyendo enzimas mitocon-driales que participan en la síntesis de ATP y el me-tabolismo de ácidos grasos, dos procesos que se ven alterados en colestasis. Además, dos de las proteínas LGHQWL¿FDGDVIXHURQOD6DGHQRVLOPHWLRQLQDVLQWHWD-sa (también llamada metionina adenosiltransferasa, MAT), y la betaína-homocisteina S-metiltransferasa (BHMT), dos importantes enzimas implicadas en el ciclo de la metionina cuya alteración es frecuente-mente observada en procesos colestásicos.)LJXUDProducción de NO y expresión del gen Nos2 en ratas BDL. Figura 4. Detección de proteínas S-nitrosiladas en ratas BDL. *Lisado hepático incubado in vitro con GSNO.88 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52Nombre de la proteínaNúmero de acceso NCBINúmero de péptidosCobertura de VHFXHQFLD LocalizaciónProteínas del citoesqueletoĮDFWLQD P62738  1 10 Cit7XEXOLQDFDGHQDȕ$ P04691 1 4 CitEnzimas metabólicasS-adenosil metionina sintetasa tipo 1 P13444 1 6 CitAldehido deshidrogenasa, microsomal P30839 2 5 RE$73VLQWDVDVXEXQLGDGĮ P15999 1 2 MitBetaina-homocisteina S-metil-transferasa 2 Q68FT5 1 4 CitCarbamoil-fosfato sintasa 1 P07756 13 20 MitCarboxilesterasa 3 precursor P16303 3 7 REDihidroxiacetona quinasa Q4KLZ6 2 6 RE10-formiltetrahidrofolato deshidrogenasa P28037 2 3 CitFructosa-bifosfato aldolasa B P00884 3 11 CitGlutamato deshidrogenasa 1 P10860 1 5 MitHidroximetilglutaril-CoA sintasa P22791 3 17 Mit3-cetoacil-CoA tiolasa P13437 1 8 MitL-lactato deshidrogenasa, cadena A P04642 1 6 CitAcido graso CoA ligasa, cadena larga 1 P18163 2 9 MitMalato deshidrogenasa P04636 1 21 MitPiruvato carboxilasa mitocondrial precursor P52873 2 6 MitChaperonas moleculares+63ȕ P34058 1 6 CitPDI P04785 2 9 RERiboforina 1 P07153 2 7 RE(Q]LPDVGHGHWR[L¿FDFLyQGlutatión S-transferasa Mu 1 P04905 2 28 CitGlutatión S-transferasa Mu 2 P08010 3 22 CitProteínas de señalización)DFWRUGHHORQJDFLyQĮ P62632 1 4 CitOtrasAlbúmina de suero, precursor P02770 3 12 SecTabla 1. 3URWHtQDV6QLWURVLODGDVLGHQWL¿FDGDVPHGLDQWH/&0606HQOLVDGRVGHKtJDGRVGHUDWDV%'/3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 89Conclusiones1XHVWURV UHVXOWDGRV DSR\DQ HO EHQH¿FLR WHUD-péutico de inhibir la síntesis de NO, en un contexto colestásico, al facilitar la homeostasis de nitroso-tioles. y proporcionan dianas de S-nitrosilación que posibilitarán el desarrollo de nuevas terapias en do-lencias colestásicas.AgradecimientosFinanciado por FIS PI 07/0159Referencias[1] López-Sánchez LM, Corrales FJ, Barcos M, Es-pejo I, Muñoz-Castañeda JR, Rodríguez-Ariza A. Inhibition of nitric oxide synthesis during induced cholestasis ameliorates hepatocellular injury by facilitating S-nitrosothiol homeos-tasis. Lab Invest. 2009 Oct 5. DOI: 10.1038/labinvest.2009.104.Figura 5. Actividad GSNOR hepática y expresión del gen Adh5 en ratas BDL. 

La inhibición de la síntesis de óxido nítrico durante la colestasis inducida experimentalmente reduce la lesión hepatocelular al facilitar la homeostasis de nitrosotioles

La inhibición de la síntesis de óxido nítrico durante la colestasis inducida experimentalmente reduce la lesión hepatocelular al facilitar la homeostasis de nitrosotioles

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