Gil, C.

Gutiérrez, M. Dolores

Hernáez, M. Luisa

Molero, Gloria

Reales-Calderón, José Antonio

Repositorio Institucional de la Universidad de Córdoba

3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 135AbstractEl  estudio del citoesqueleto de macrófagos mu-rinos en la interacción con Candida albicans resulta de gran interés por los importantes cambios que ocu-rren en una célula fagocítica tras entrar en contacto con un “cuerpo extraño”. La fagocitosis conlleva alteraciones en el citoesqueleto de actina, tubulina y miosina y de las proteínas que se asocian a ellas $US &RURQLQD:$63:$9(« (VWXGLRVprevios basados en la obtención de subproteomas de macrófagos utilizando una extracción secuencial y analizados mediante 2D-DIGE, nos ha permitido observar un gran número de proteínas en la frac-ción enriquecida en citoesqueleto que aumentan su expresión tras interaccionar con C. albicans. Sin HPEDUJRVyORSURWHtQDVSXGLHURQVHULGHQWL¿FDGDV&RQREMHWRGHLGHQWL¿FDUXQPD\RUQ~PHURGHSUR-teínas hemos puesto a punto un método más especí-¿FRSDUDODH[WUDFFLyQ de proteínas de citoesqueleto. Utilizando esta estrategia nos hemos encontrado con que se produce un aumento considerable en la can-tidad de proteína tras la interacción en comparación FRQHOFRQWUROGL¿FXOWDQGRODQRUPDOL]DFLyQGHODVmuestras a analizar. Resultados PreviosEstudios previos de nuestro laboratorio de las proteínas presentes en diferentes subproteomas ob-tenidos por extracción secuencial con el kit Pro-teoExtract® Subcellular Proteome Extraction Kit de Calbiochem y analizadas por DIGE, mostraron muchas proteínas con expresión diferencial en la fracción enriquecida en citoesqueleto. Sin embar-JRSRFDVSURWHtQDVSXGLHURQ VHU LGHQWL¿FDGDVSRUencontrarse en muy baja concentración (Reales-Calderón J. A.; Martínez-Solano L.; Molero G.; Gil C.; resultados no publicados). Se analizó esta Expresión diferencial de proteínas del citoesqueleto del macrófago tras la interacción con Candida albicans: Problemas en la normalización de las muestrasJose Antonio Reales-Calderón1, Mª Luisa Hernaez2, Mª Dolores Gutiérrez2, Gloria Molero1,Concha Gil1,21Departamento de Microbiología II. Facultad de Farmacia. Universidad Complutense de Madrid. 2UnidadGH3URWHyPLFD8QLYHUVLGDG&RPSOXWHQVHGH0DGULG3DUTXH&LHQWt¿FRGH0DGULG8&03&0fracción por cromatografía líquida, aumentando el Q~PHURGHSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDV\UHYHODQGRTXHen la muestra extraída con el kit había muy pocas proteínas propias de citoesqueleto. Obtención de las muestras de citoesqueletoUtilizando protocolos de extracción más espe-Ft¿FRVSDUDSURWHtQDVGHFLWRHVTXHOHWRHOHJLPRVHOGHVFULWRSRU)XQFKDO>@OLJHUDPHQWHPRGL¿FDGR'L-cho método se basa en la utilización independiente de dos tampones con diferente concentración de sales: un tampón con alto contenido en sales (High-salt), FRQHOFXDOVHH[WUDHODIUDFFLyQHQULTXHFLGDHQ¿OD-mentos intermedios de citoesqueleto; y otro de bajo contenido en sales (Low-salt), con el que se extraen IXQGDPHQWDOPHQWH¿ODPHQWRVLQWHUPHGLRVWXEXOLQDVactinas y proteínas asociadas al citoesqueleto.El análisis preliminar de las muestras por cro-PDWRJUDItDOtTXLGDSXVRGHPDQL¿HVWRXQHQULTXHFL-miento muy importante en proteínas de citoesquele-to con respecto a la fracción extraída con el kit.Extracción de las muestras de iTRAQSe realizó la extracción de proteínas de citoes-queleto con estos dos tampones, partiendo de un número constante de macrófagos, y realizamos 3 UpSOLFDVELROyJLFDV$O FXDQWL¿FDU REVHUYDPRVXQaumento considerable (150%) de la cantidad de pro-teína de citoesqueleto en las muestras extraídas con el tampón High-salt procedentes de macrófagos que habían interaccionado con C. albicans  con respecto a los macrófagos control. Dichas diferencias en la cantidad de proteína no se producían en las muestras extraídas con el tampón Low-salt, como se puede observar en la Figura 1. 136 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52Figura 1. Geles monodimensionales teñidos con Coomasie Coloidal de muestras enriquecidas en proteínas de citoes-queleto. Izquierda: Tampón High-salt; Derecha: Tampón Low-Salt. Cnt: Macrófagos control; Int: Macrófagos tras la interacción con C. albicans.Para realizar el iTRAQ habría que igualar la concentración de las muestras antes de marcar. Si lo hiciéramos con las muestras extraídas con el tam-pón High Salt, estararíamos aumentando las con-centraciones de las proteínas de la muestra de los macrófagos control, alterando los resultados de la FRPSDUDFLyQ&RQHOREMHWRGHFXDQWL¿FDUHVWDH[-presión diferencial tan importante, hemos decidido igualar en el número de células de partida en todos ORVFDVRV\UHVXVSHQGHUHQHOPLVPRYROXPHQ¿QDOantes de marcar con iTRAQ.Vamos a comenzar el análisis de las muestras extraídas con el tampón Low-salt, el cual no plantea problemas de concentración y después se procederá al análisis de las muestras extraídas con el tampón High-salt, donde hay un aumento del 150% de las proteínas tras la interacción con la levadura.AgradecimientosLos autores expresan su agradecimiento a la Comisión Internacional de Ciencia y Tecnología SUR\HFWR%,2 SRU ODV D\XGDV¿QDQ-cieras recibidas.Referencias [1] Funchal C, de Almeida LM, Oliveira Loureiro S, Vivian L, de Lima Pelaez P, Dall Bello Pessutto F, et al. In vitro phosphorylation of cytoskeletal proteins from cerebral cortex of rats. Brain re-search 2003;11:111-8.3URWHyPLFDGH3DUiVLWRV3UREOHPiWLFDHQODLGHQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDVGHSDUiVLWRVJavier Sotillo1, Ana Pérez García1, María Trelis1, Dolores Bernal2, Carla Muñoz-Antolí1, José Guillermo Esteban1, Rafael Toledo1, Antonio Marcilla11Departamento de Biología Celular y Parasitología, Facultat de Farmàcia, Universitat de València. 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultat de Biologia, Universitat de ValènciaEl principal problema al que se enfrentan los investigadores que trabajan en proteómica parasita-ria es la falta de genomas completos de los parási-tos estudiados. Tan solo se encuentran disponibles los de Schistosoma mansoni y Schistosoma japo-nicum, [1,2], además de  numerosas entradas de DNA depositadas en bases de datos. El hecho de que existan tantas entradas de Schistosoma en bases de GDWRVGHSURWHtQDVKDSRVLELOLWDGRODLGHQWL¿FDFLyQde numerosas proteínas de otros trematodos como los echinostomátidos [3]. Sin embargo, no siempre pueden usarse bases de datos de otros parásitos para ODLGHQWL¿FDFLyQGHELGRDODIDOWDGHKRPRORJtDHQWUHproteínas. Ha de tratarse de proteínas conservadas que mantengan una cierta homología entre dife-rentes géneros de parásitos. Además, en el caso de SchistosomaFDVLODPLWDGGHSURWHtQDVLGHQWL¿FDGDVde sus transcriptomas no tienen función conocida o VRQLQFOXVRHVSHFLHHVSHFt¿FDV>@En el caso de Echinostoma, no sólo no se tiene el transcriptoma entero, sino que existen muy pocas 

Expresión diferencial de proteínas del citoesqueleto del macrófago tras la interacción con Candida albicans: Problemas en la normalización de las muestras

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