Curto Rubio, Miguel

García-Martínez, Teresa

Luna, Carlos

Mauricio, Juan Carlos

Repositorio Institucional de la Universidad de Córdoba

118 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52B) Proteómica de HongosAnálisis comparativo del proteoma de una cepa industrial de Saccharomycescerevisiae en dos condiciones de cultivoCarlos Luna1, Teresa García-Martínez1, Miguel Curto2, Juan Carlos Mauricio11Departamento de Microbiología. 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de &yUGRED&DPSXVGH5DEDQDOHV(GL¿FLR6HYHUR2FKRDLa levadura Saccharomyces cerevisiae es uno de los organismos modelo utilizados en Biología Mole-cular, y además es un organismo que tiene un gran valor comercial. La mayoría de los estudios sobre proteómica de levadura se ha realizado sobre cepas de laboratorio, y existen pocos datos sobre levaduras de interés industrial. Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo anaerobio facultativo. Durante el proceso de fermentación, la levadura se adapta ¿VLROyJLFDPHQWHDGLVWLQWRVHVWUHVHVFRPRVRQHOH-vada presión osmótica, agotamiento de la fuente de carbono como la glucosa y la aparición de etanol, que le es tóxico. Durante la fermentación alcohólica, &KHQJ\FRODERUDGRUHV>@KDQLGHQWL¿FDGRHQ]LPDVimplicadas en las rutas de las pentosas fosfato, gli-colisis, gluconeogénesis, biosíntesis del glicerol y también proteínas de choque térmico. El objetivo de HVWHHVWXGLRKDVLGRFRPSDUDUHOSHU¿OSURWHyPLFRde una levadura industrial en dos medios de cultivo: medio fermentativo con glucosa y medio oxidativo con glicerol y etanol.La levadura Saccharomyces cerevisiae G1, ais-lada de un vino de la D.O Montilla-Moriles, creció en dos condiciones: en un medio fermentativo, me-dio completo YPD compuesto por 17% de glucosa, 1% de extracto de levadura, 2% peptona bacterioló-gica; y en un medio oxidativo formado por 0.67% de YNB, ácido glutámico 10mM, 1% de glicerol y 15% de etanol. Finalizado el experimento, las células de levadura se recogieron por centrifugación a 3.000 x g a 4º C durante 10 minutos. Posteriormente, se realizó una lisis física con bolas de vidrio y una lisis química con 20 ml totales de tampón de extracción compuesto por tampón Tris 100 mM, a pH 8,0, PMSF 1mM, EDTA1 mM, DTT2 mM, y un cóctel de inhibidores de proteasas (Roche). El extracto de proteínas se precipitó con TCA-Acetona-DTT 0.07% durante 24 horas a -20ºC. Se resuspendió en tampón de solubilización (Urea 8M, 2% CHAPS \'77P0/D FXDQWL¿FDFLyQGHSURWHtQDV VHdeterminó mediante el método Bradford [2]. IEF-2D: Se utilizaron tiras con gradientes de pH inmo-vilizados (IPG) de 17 cm, de gradiente no lineal 3-10, (Bio-Rad). Se rehidrataron pasivamente du-rante 2 horas con 500 µg de proteína en 300 µL de tampón de solubilización (Urea 8M; 2% CHAPS; 0,5% tampón IPG 5-8, 3-10, 30 mM DTT, y azul de bromofenol 0.01%) [3]. Las tiras se cargaron en IEF CELL (Bio-Rad) para ser enfocadas por su SXQWRLVRHOpWULFRFRQXQSURJUDPDHVSHFt¿FR/RVgeles de poliacrilamida al 13% fueron sometidos a electroforesis en PROTEAN II CELL. Los geles fueron teñidos con azul de coomassie G-250 durante 24 h por el método descrito por Mathesius y cola-boradores [4]. Las imágenes fueron adquiridas con un densitómetro GS-800 calibrado y se analizaron con el software PDQuest 8.0.1 (Bio-Rad). Se calcu-laron los puntos isoelétricos según la distribución de las tiras, y los pesos moleculares según el patrón GHSHVRVREWHQLGRV\UHÀHMDGRVHQORVJHOHVFRQORVmarcadores correspondientes. Ciertos spots obteni-dos tanto en fermentación como en medio oxidativo están secuenciados mediante MALDI-TOF/TOF en el Centro de Genómica y Proteómica - Unidad de Proteómica - Facultad de Farmacia. Universidad &RPSOXWHQVHGH0DGULG3DUTXH&LHQWt¿FRGH0D-drid (UCM-PCM).Hemos obtenidos 477±20 spots en geles de fer-mentación. En el caso geles de medio oxidativo se KDQFXDQWL¿FDGRVSRWVWRWDOHV6HKDQLGHQWL¿FDGRVSRWVTXHHVWiQSUH-sentes tanto en los geles correspondientes al medio de fermentación como en los geles pertenecientes al medio oxidativo, éstos son los spots comunes.Se ha observado que la expresión de los spots en geles de medio oxidativo está mucho menos acen-3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 119tuada que en los geles de fermentación, así como que el número total de spots expresados es menor que en el caso de fermentación.Se ha comprobado que las proteínas en ambos geles bidimensionales pertenecen fundamentalmen-te a la glicolisis, gluconeogénesis y biosíntesis de glicerol. Por otro lado, se han encontrado proteínas expresadas en medio oxidativo que no están pre-sentes en medio de fermentación. Estas proteínas se relacionan con el estrés oxidativo y actualmente están siendo estudiadas. La mayoría de las proteí-QDVFXDQWL¿FDGDVVHHQFXHQWUDQHQODEDVHGHGDWRVde SwissProt de Saccharomyces cerevisiae (www.expasy.ch/sprot).Agradecimientos(VWHWUDEDMRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHO0LQLVWHULRde Ciencia e Innovación (INIA) proyecto RTA2008-00056-C02-02 y FEDER.Referencias[1] Cheng JS, Qiao B, Yuan YJ. Comparative proteome analysis of robust Saccharomyces cerevisiae insights into industrial continuous and batch fermentation. Appl Microbiol Biotechnol 2008; 81:327-338.[2] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976;72:248-254.[3] Kolkman A, Slijper M, J.R. Heck A. Develop-ment and application of proteomics technologies in Saccharomyces cerevisiae. Trends in Biote-chnol 2005; 23:12.>@ 0DWKHVLXV8.HLM]HUV61DWHUD+$:HLQPDQJJ, Djordjevic MA, Rolfe BG. Establishment of a root proteoma reference map for the model legume Medigaco trunculata using the ex-pressed sequence tag database for peptide mass ¿QJHUSULQWLQJ3URWHRPLFVTradicionalmente, la levadura Saccharomyces ce-revisiae se ha usado en alimentación, principalmente por su producción de etanol en bebidas alcohólicas durante miles de años. La avanzada biotecnología de las células inmovilizadas en procesos fermentativos de interés aporta una serie de ventajas técnicas y económicas frente a los sistemas convencionales de células libres [1]. Nuestro grupo de investigación ha puesto a punto un sistema de bioinmovilización que consiste en una co-inmovilización espontánea de un KRQJR¿ODPHQWRVRPenicillium chrysogenum H3) y una levadura (Saccharomyces cerevisiae G1), en au-sencia de compuestos químicos de unión y de sopor-WHVH[WHUQRVPHGLDQWHODFUHDFLyQDUWL¿FLDOPHQWHGHcondiciones adecuadas para favorecer una simbiosis [2]. Al inmovilizado creado, que son esferas huecas de ambos microorganismos, lo hemos denominado “biocápsulas de levadura”, y éstas pueden ser apli-cadas a diversos procesos fermentativos. El objetivo Estudio proteómico comparativo de células de Saccharomyces cerevisiae libres y bioinmovilizadasTeresa García-Martínez, Juan Carlos Mauricio'HSDUWDPHQWRGH0LFURELRORJtD8QLYHUVLGDGGH&yUGRED&DPSXVGH5DEDQDOHV(GL¿FLR6HYHUR2FKRDde este trabajo ha sido realizar un estudio proteómico comparativo entre las células de levadura en forma libre y en forma bioinmovilizada en el medio de for-mación de las biocápsulas de levadura.Los microorganismos usados en este estudio han sido una cepa de Saccharomyces cerevisiae var. ca-pensis G1, aislada de un vino bajo crianza biológica de la D.O. Montilla-Moriles y un hongo, Penicillium chrysogenum H3, aislado del ambiente. El medio de cultivo y las condiciones en las que se produjo la bioinmovilización fueron: medio YNB que contiene ácido glucónico como fuente de carbono, amonio como fuente de nitrógeno y tamponado a pH 7. Dos matraces Erlenmeyer de 250 mL con 150 mL de me-dio de formación de biocápsulas se inocularon con 4 x 106 células de G1/mL y un asa de siembra del hongo H3. Se incubaron a 28ºC en un agitador orbital a 200 rpm durante 7 días, formándose durante este 

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