Gómez-Gascón, Lidia

Olaya-Abril, Alfonso

Rodríguez-Ortega, Manuel J.

Repositorio Institucional de la Universidad de Córdoba

110 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52nas con Fenol/Cloroformo/Alcohol Isoamílico (25:24:1 v/v/v) [3]. La cantidad de proteínas recuperadas es baja.5RWXUDFRQ75,5HDJHQW6LJPD/DH¿FLHQFLDGHrotura es buena, sin embargo, la cantidad de proteí-nas recuperadas tras seguir el protocolo es baja.Para aumentar la resolución y el enfoque de las proteínas en 2-DE se están ensayando, en los extractos totales potencialmente más idóneos para nuestro estudio, el detergente ASB-14, el DeStreak y el método de cargado de las tiras de IPG mediante “cup loading”.Agradecimientos(VWHWUDEDMRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHOSUR\HFWRSAF2008-00733 del Ministerio de Ciencia e Inno-vación, Gobierno de España.Referencias[1] Raj K. Upreti Manoj K., y V. Shankar. Bacterial glycoproteins: Functions, biosíntesis and appli-cations. Proteomics 2003; 3: 363-379.[2] Balanova L., Hernychova L., Bilkova Z. Bioa-nalytical tools for the discovery of eukaryotic glycoproteins applied to the análisis of bacterial glycoproteins. Expert Rev. Proteomics 2009; 6(1), 75-85.>@ $QWRQLROL3%DFKL$)DVROL(5LJKHWWL3(I¿-cient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map análisis. Journal of Chromatography A, 1216 2009; 3606-3612.>@ &KRH:\0LGGHOEHUJ$6HOHFWLYH3UHFLSLWD-tion of DNA by Spermine during the Chemical Extraction of Insoluble Cytoplasmic Protein. Biotechnol. Prog. 2001; 17: 1107-1113.>@ (QFKHYD9*KDUELD6:DLW5%HJXP6\Shah H. Comparison of extraction procedures for proteome analysis of Streptococcus pneu-moniae and a basic reference map. Proteomics 2006; 6: 3306–3317.Resumen8QDGHODVIRUPDVPiVFRPXQHVGHPRGL¿FDFLR-nes postraduccionales de proteínas es la glicosilación. Se estima que más del 50% de las proteínas conoci-das, así como el 80% de las proteínas de membrana, están glicosiladas. En contra de lo que se creía, se ha demostrado que los procariotas también poseen gli-coproteínas. Las glicoproteínas bacterianas parecen HVWDUDVRFLDGDVDODVXSHU¿FLHGHOPLFURRUJDQLVPREste hecho sugiere por tanto que están implicadas en la interacción de la bacteria con el hospedador  y por tanto puede existir una relación directa con la ca-pacidad patógena del microorganismo. El objeto de este estudio consiste en desarrollar una metodología, Métodos de enriquecimiento de glicoproteínas bacterianas para su posterior análisis y caracterización mediante espectrometría de masasLidia Gómez-Gascón, Alfonso Olaya, Manuel J. Rodríguez-OrtegaDepartamento de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad de Veterinaria. Universidad de CórdobaPHGLDQWHGLYHUVDVFURPDWRJUDItDVGHD¿QLGDGSDUDHOHQULTXHFLPLHQWR\SXUL¿FDFLyQGHJOLFRSURWHtQDVGHbacterias del género Streptococcus.En contra de lo que estaba establecido hasta hace unos años, recientemente se ha demostrado que los procariotas producen glicoproteínas [1]. Estas SDUHFHQ HVWDU DVRFLDGDV D OD VXSHU¿FLH GHOPLFUR-organismo, lo que sugiere que están implicadas en la interacción con el hospedador y por tanto, con la capacidad patógena del microorganismo. Hay dos ti-pos de glicosilación en procariotas: N-glicosilación, en la cual los glicanos están unidos a un residuo de asparagina, y O-glicosilación, en la cual está unido a un residuo de serina, treonina o tirosina [1,2].3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52 111Para el enriquecimiento de glicoproteínas, los métodos que hemos utilizado se basan en croma-WRJUDItDV GH D¿QLGDGXVDQGR OHFWLQDV DVt FRPR ODquímica de la hidrazida y del ácido aminofenilbo-rónico [1,3]./DVOHFWLQDVVRQSURWHtQDVTXHVHXQHQHVSHFt¿-camente a motivos oligosacarídicos, reconociendo cada una a un subgrupo de especies de glicanos. Para asegurar el reconocimiento del mayor nú-mero de glicoproteínas, se está poniendo a punto una batería de lectinas: Canavalia ensiformis lec-tin (ConA), que reconoce principalmente residuos deĮPDQRVD\ĮJOXFRVDUlex europaeus lectin8($ UHFRQRFH UHVLGXRV GH Į/IXFRVDTriti-cum vulgaris lectin :*$ UHFRQRFH grupos N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido siálico; Ara-chis hypogaea lectin $+ UHFRQRFH ȕJDO!galNAc; y Bandeiraea simplivifolia lectin (BC-1) UHFRQRFHĮJDODFWRVD\ĮJDO1$FLos extractos proteicos se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%, y pos-WHULRUPHQWHVHWUDQV¿ULHURQDPHPEUDQDVGHQLWURFH-lulosa, las cuales se bloquearon con gelatina al 3%, se hibridaron con cada una de las cinco lectinas, se incu-baron con estreptavidina-HRP y se revelaron mediante quimioluminiscencia. [1,2,4]. Resultados preliminares han indicado hasta ahora que tanto la ConA como la AH son las lectinas que reconocen un mayor número de glicoproteínas ya que revelan un mayor número de bandas a partir de extractos totales (Figura 1).Figura 1. Blotting con lectinas de extractos totales de Strep-tococcus pneumoniae. Calles de izquierda a derecha: ConA, A.H., WGA, UEA-I, BC-I. El segundo método de enriquecimiento está ba-sado en la química de la hidrazida [6], mediante la cual dicho grupo funcional reacciona con los grupos cis-diol de los residuos de azúcares, previamente oxidados a aldehídos, para formar un enlace hidra-zona. Para ello se está poniendo a punto una croma-tografía con una resina de hidrazida (Bio-Rad). En primer lugar las muestras se oxidan con peryodato sódico, y después la muestra se hace pasar por la resina para permitir la formación de los enlaces hidrazona. El resto de proteínas no glicosiladas se eliminan mediante lavados. Posteriormente las gli-coproteínas se digieren con tripsina y se recogen mediante lavados los péptidos generados, que co-rresponden a las proteínas glicosiladas, quedando los glicopéptidos unidos a la resina. Los N-glicopép-tidos pueden recuperarse de la resina digiriendo con la glicosilasa PNGasa F, ya que esta enzima corta el sitio de unión del glicano a la asparagina. Para OLEHUDUORV2JOLFRSpSWLGRVVHUHDOL]DȕHOLPLQDFLyQcon dimetilamina al 26%, que convierte las serinas y treoninas glicosiladas en alanina y ácido 2-aminobu-tírico respectivamente [1-2-3,6]. Tras hacer pasar la tripsina por la resina para digerir las proteínas rete-nidas y analizar los péptidos mediante nano-LC/MS/06 VH LGHQWL¿FDURQPXFKDVSURWHtQDVFLWRSODVPiWLFDVen principio no esperadas.Figura 2. Gel teñido con Coomassie de proteínas obtenidas WUDVSXUL¿FDUFRQiF$PLQRIHQLOERUyQLFRH[WUDFWRVWRWDOHVde Streptococcus pneumoniae. Calles de izquierda a dere-FKDHOXLGRÀRZWKURXJKH[WUDFWRWRWDOEl tercer método consistió en la cromatografía GHD¿QLGDGXVDQGR ODTXtPLFDGHO iFLGRDPLQRIH-nilborónico, que forma enlaces covalentes con los grupos cis-diol de residuos de glucosa, manosa y galactosa en condiciones de alcalinidad, dando lu-gar a diésteres, siendo estos enlaces reversibles en condiciones ácidas. Se usó como tampón de unión a la resina taurina 50 mM /NaOH, pH 8.7 + 20 mM MgCl2, y de elución igual al anterior pero con 50 mM Tris/HCl, pH 7.5 [1, 2, 5]. El eluido se separó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 12% (Figura 2), y las bandas se analizaron por 0$/',72)06LGHQWL¿FiQGRVH~QLFDPHQWHSUR-teínas citoplasmáticas. Además, el eluido se digirió 112 3527(Ï0,&$1Ò0(52)(%5(52en solución con tripsina y se analizó  mediante ESI-MS/MS, dando también como resultado principalmente proteínas citoplasmáticas.Agradecimientos(VWHWUDEDMRKDVLGR¿QDQFLDGRSRUHOSUR\HFWRSAF2008-00733 del Ministerio de Ciencia e Inno-vación, Gobierno de España.Referencia[1] Balonova L., et al. Bioanalytical tools for the discovery of eukaryotic glycoproteins applied to the analysis of bacterial glycoproteins. Expert Rev. Proteomics 2009; 6 (1): 75-85.[2] Capote F.P. y Sanchez J.C.. Strategies for proteo-mic amalysis of non-enzymatically glycated pro-WHLQV:LOH\LQWHU6FLHQFH'2,mas.20187.[3] Greis K. et al. Selective Detection and Site-$QDO\VLVRI2*OF1DF0RGL¿HG*O\FRSHSWLGHVby B-Elimination and Tandem Electrospray Mass Spectrometry. Analytical Biochemistry 1996; 234: 38-49.>@ .DML+HWDO/HFWLQDI¿QLW\FDSWXUHLVRWRSHcoded tagging and mass spectometry to identify N-linked glycoproteins. Nature biotechnology 2003;  v.21, n.6.>@ 0R]DQR$ HW DO%RURQLF DFLGOHFWLQ DI¿QLW\chromatography.1.Simultaneous glycoprotein binding with selective or combined elution. Anal Bioanal Chem. 2007; 389: 2097-2102.>@ =KDQJ+HWDO,GHQWL¿FDWLRQDQGTXDQWL¿FDFLRQof N-linked glycoproteins using hydrazide che-mistry, stable isotope labeling and mass spectomr-try. Nature biotechnology. 2003; v. 21, n. 6.ResumenLas bacterias del género Staphylococcus son mi-croorganismos de amplia distribución, causantes de numerosas intoxicaciones alimentarias debido, en gran medida, a su capacidad de producir entero-toxinas. La enterotoxina del serotipo A es la que con más frecuencia aparece en los brotes de intoxica-ción alimentaria. En el presente trabajo se desarrolla una técnica de análisis de muestras de leche por MALDI-TOF para la detección de la enterotoxina $HVWD¿ORFyFLFD(VWHPpWRGRSUHVHQWDFRPRYHQ-tajas sobre las técnicas actualmente utilizadas su JUDQHVSHFL¿FLGDG\HOHYDGDUDSLGH]/RVUHVXOWDGRVobtenidos mostraron la efectividad de la extracción Análisis de la enterotoxina A de Staphylococcus aureus en leche por ionización mediante desorción por láser asistida por matriz, acoplada a espectrometría de PDVDVGHWLHPSRGHYXHOR0$/',72)Isabel Sospedra, Carla Soler, Jose Miguel Soriano, Jordi MañesDepartamento de Medicina Preventiva y Salud Pública, Ciencias de la Alimentación, Toxicología y Medicina Legal. Facultad de Farmacia. Universitat de Valènciautilizada demostrando la utilidad del método de análisis utilizado.Staphylococcus aureus es una bacteria patógena, de amplia distribución en la naturaleza, asociada a infecciones generalizadas y brotes alimentarios [1]. $OJXQDVHVSHFLHVGHHVWD¿ORFRFRVVRQSURGXFWRUDVde una familia de proteínas no glicosiladas de bajo peso molecular (Mr22-31.000) conocidas como en-terotoxinasHVWD¿ORFyFLFDV6(V Estas enterotoxi-nas son causa de intoxicaciones alimentarias por la ingesta de productos contaminados, principalmente de origen cárnico y lácteo [2-3] destacándose la en-terotoxina A [4], que es la que con mayor frecuencia se asocia a brotes de intoxicación alimentaria y que es extremadamente potente.

Métodos de enriquecimiento de glicoproteínas bacterianas para su posterior análisis y caracterización mediante espectrometría de masas

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