Casado-Vela, Juan

Casal, Ignacio

Martínez, J.

Romero, S.

Repositorio Institucional de la Universidad de Córdoba

42 PROTEÓMICA • NÚMERO 1 • FEBRERO 20082. MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALESHerramientas de cuantifi cación en fosfoproteómica: el uso de la tecnología híbrida triple cuadrupolo- trampa de iones 4000 QTRAPSerna A.Applied Biosystems Madrid.La cuantifi cación es una técnica dentro de la proteómica que está adquiriendo una importancia creciente como herramienta fundamental para el entendimiento de numerosos procesos biológicos. En transducción de señal o en la búsqueda de bio-marcadores, pequeños cambios en los niveles de ciertas proteínas o de sus isoformas, pueden en rea-lidad esconder la clave para entender mejor ciertos mecanismos celulares. La fosforilación es una mo-difi cación post-traduccional que altera o modifi ca las características fi sicoquímicas de las proteínas. Este cambio puede afectar a su solubilidad, a su estructura terciaria y en defi nitiva a su actividad o función. Estas variaciones no son más que los deto-nadores de otros cambios más profundos que van a concluir con una respuesta celular a un determinado estímulo. La fosforilación afecta a cerca del 30% del proteoma, y alrededor del 10% de esas fosfori-laciones, representan cambios que regulan procesos de vital importancia en la célula. Parece obvio por tanto, resaltar la importancia no solo de la identifi -cación de las proteínas fosforiladas y sus residuos de fosforilación, sino sobre todo, de la cuantifi ca-ción de los cambios en el equilibrio entre las distin-tas isoformas. Hemos de entender la fosforilación como un proceso altamente dinámico. Trabajar en la identifi cación de sitios de fosforilación requiere una sólida estrategia y equipos que gocen de cierta versatilidad y sensibilidad en el análisis. Si además queremos cuantifi car los cambios que están ocu-rriendo, necesitamos equipos que ofrezcan un alto rango dinámico y una estrategia de cuantifi cación reproducible. En la siguiente exposición se destaca-rá el papel que puede desempeñar en estos estudios los métodos de marcaje isobárico como el iTRAQ y la importancia de los métodos dirigidos de análisis (MRMs) empleando triples cuadrupolos, en la ca-racterización y cuantifi cación de fosfopéptidos.Monomeric and heterodimeric differential phosphorylation pattern in the Cyclin-A2/CDK2 complexCasado-Vela, J.; Martinez, J.; Romero, S.; Casal, I.J.Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, CNIO, MadridThe Cyclin-A2/CDK2 is a protein heterodimer with kinase activity that plays a key role in centro-some duplication and meiotic cell division. In this study we used baculovirus-infected cells for the production of both, monomers and the heterodimer. We used a segmented linear ion trap mass spectro-meter to identify the phosphorylated residues in Mus musculus Cyclin-A2 and CDK2 proteins, after individual expression in baculovirus and after for-mation of the heterodimer. By using a combination of trypsin and chymotrypsin digests to increase the sequence coverage and data dependent neutral loss PROTEÓMICA • NÚMERO 1 • FEBRERO 2008 43(DDNL) for phosphopeptide analysis, we identifi ed a differential phosphorylation pattern before and af-ter the formation of the protein complex. The analy-sis of the individual proteins showed that Cyclin-A2 is phosphorylated on two Ser residues (Ser14 and Ser421) and CDK2 on a single residue (Thr160). After the formation of the heterodimer Cyclin-A2 was phosphorylated only on Ser14 whereas CDK2 presented two Thr residues (Thr39 and Thr160). These results suggest that baculovirus expression represents an effi cient system for the production of functional proteins and the analysis of authentic phosphorylation sites in regulatory proteins.ReferencesAbbas, T., Jha, S., Sherman, N.E., Dutta, A. Cell Cycle. 2007. 6: 843-852.Casado-Vela, J., Ruiz, E.J., Nebreda, A., Casal, I. Pro-teomics. 2007: 7, 2522-2529.Malumbres, M., Barbacid, M. Nature Reviews in Can-cer. 2002. 1: 222-231.Ortega, S, Prieto, I., Odajima, J., Martin, A., et al.. Nature Genetics. 2003. 35: 25-37.Identifi cación de fosfopéptidos en células T humanas primarias mediante IMAC y TIO2 secuencialCasas V, Carrascal M, Ovelleiro D, Gay M, Abián J.LP-CSIC/UAB, IIBB-CSIC, IDIBAPS, Rosellón 161, 7 Planta , 08036 Barcelona, Spain. IntroducciónLa fosforilación de proteínas es uno de los principales mecanismos para la regulación de la función celular en eucariotas. El conjunto de prote-ínas fosforiladas de una célula, tejido u organismo constituye el denominado fosfoproteoma. Un mal funcionamiento de los mecanismos de fosforilación proteica puede tener graves implicaciones patoló-gicas y pueden ser la causa o la consecuencia de enfermedades autoinmunes como la diabetes o la artritis reumatoide o de enfermedades que, como el cáncer, implican fallos en la regulación de la pro-liferación o diferenciación celular. Fármacos como la ciclosporina o la rapamicina son inhibidores de cinasas y fosfatasas. La identifi cación de nuevos substratos de fosforilación y la caracterización de sus funciones así como de sus niveles en diversas condiciones son pasos necesarios tanto para me-jorar la comprensión de los mecanismos celulares como para el desarrollo de nuevos fármacos. Con este objetivo en este trabajo se han puesto a punto tecnologías combinadas de purifi cación haciendo uso de columnas IMAC y  TiO2 para la purifi cación de fosfopéptidos a partir de células T humanas pu-rifi cadas de sangre periférica. Material y métodos-  Preparación de las muestras: los pellets enriquecidos en linfocitos T se obtuvieron a partir de concentrados leucoplaquetarios mediante centrifugación en gradiente de Ficoll, se lisaron en 6M urea, 50 mM Tris pH 7.4, DTT, inhibidores de fosfatasas y proteasas y las proteínas se precipitaron con 10% TCA y lavado con acetona y se sepa-raron  mediante SDS-PAGE. El gel se tiñó con Coomassie y se cortó en 11 bandas que se digirieron con tripsina. El extracto pep-tídico se evaporó y se redisolvió en 100 µl de 250 mM AcOH/30% ACN-  Purifi cación con IMAC y TiO2: se adicio-naron 20 µl de fase Phos-Select a la mezcla de péptidos y se incubó durante 90 min. Los fosfopéptidos se eluyeron con  1% NH4OH (1) El material no retenido se diluyó en 1M ácido glicólico, 5%TFA, 80% ACN y se cargó en una columna de TiO2 preparada en una punta de pipeta Gel Loader Tip (2). Los fosfopéptidos se eluyeron con NH4OH, pH 10.5 y con ACN al 30%. 

Monomeric and heterodimeric differential phosphorylation pattern in the Cyclin- A2/CDK2 complex

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