Lamas, S.

Martínez-Ruiz, Antonio

Tarín, Carlos

Repositorio Institucional de la Universidad de Córdoba

PROTEÓMICA • NÚMERO 1 • FEBRERO 2008 47Desarrollo de una metodología de detección fl uorescente para la detección del S-nitrosoproteoma y aplicación a células endotelialesMartínez-Ruiz A1, Tarín C1, Lamas S21Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III (CNIC), Melchor Fernández Almagro, 3 – 28029 Madrid; 2Instituto “Reina Sofía” de Investigaciones Nefrológicas, Centro de Investigaciones Biológicas, Consejo Superior de Investigaciones Científi cas (CIB-CSIC), Ramiro de Maeztu, 9 – 28040 Madrid IntroducciónLa S-nitrosilación de proteínas se está estudian-do actualmente como una modifi cación postraduc-cional no enzimática que puede constituir un nuevo paradigma en señalización celular (Martínez-Ruiz y Lamas, 2004, 2007). El estudio del S-nitrosopro-teoma se inició prácticamente con la invención de la técnica del “cambio por biotina” o “biotin switch” (Jaffrey et al., 2001). Sin embargo, esta técnica pre-senta aún algunas limitaciones, entre las cuales se puede destacar su reducida sensibilidad.Material y métodosSe han preparado extractos de células endo-teliales de la línea EA.hy926 tratadas con 1 mM S-nitrosocisteína (CysSNO), según hemos descrito previamente (Martínez-Ruiz y Lamas, 2004, 2006). El método de derivatización consta de dos pasos, incluyendo la precipitación con acetona tras cada paso: 1) bloqueo con N-etilmaleimida; 2) reducción con ácido ascórbico y marcaje simultáneo con ma-leimida fl uorescente o maleimida-biotina.Resultados y conclusionesAl cambiar la química de la derivatización para utilizar reactivos basados en maelimidas, se hicieron controles para comprobar especifi cidad y ausencia de reacciones secundarias en cada paso de la reac-ción. Posteriormente se ha comprobado la especi-fi cidad del método comparando células en estado basal o nitrosiladas con CysSNO, usando maleimi-da-biotina y comparándolo con el método de “cam-bio por biotina” ya establecido. Se han comprobado especialmente las condiciones de marcaje para evi-tar reacciones secundarias de la maleimida marcada. Finalmente, se han realizado geles bidimensionales de los extractos derivatizados, detectando simultá-neamente fl uoresceína y marcaje de proteína total con Lucy565 (Fluka), observándose un buen nú-mero de proteínas marcadas, aun empleando una cantidad sensiblemente menor de proteína que en nuestro trabajo anterior. Aunque estos resultados aún tienen que ser ana-lizados en mayor detalle, hemos desarrollado una metodología que permite aprovechar varias ventajas del marcaje fl uorescente y separación en 2D-PAGE para su aplicación al estudio del S-nitrosoproteoma: mayor sensibilidad en la detección e identifi cación de proteínas, cuantifi cación relativa mediante el em-pleo de varios fl uoróforos. Asimismo, el desarrollo de la derivatización con maleimida permite tam-bién el análisis por otras metodologías proteómicas de los sitios precisos de marcaje provenientes a S-nitrosilaciones.BibliografíaJaffrey, S. R., Erdjument-Bromage, H., Ferris, C. D., Tempst, P., Snyder, S. H. Nat Cell Biol 2001, 3, 193-197.Martínez-Ruiz, A., Lamas, S. Cardiovasc Res 2004, 62, 43-52.Martínez-Ruiz, A., Lamas, S. Arch Biochem Biophys 2004, 423, 192-199.Martínez-Ruiz, A., Lamas, S., in: Vivanco, F. (Ed.), Cardiovascular Proteomics, Humana Press, Clifton, N.J. 2006, pp. 215-224.Martínez-Ruiz, A., Lamas, S. Cardiovasc Res 2007, 75, 220-228.

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