Nogueira Álvarez, Montserrat

Repositorio Institucional de la Universidad de Córdoba

 Proteómica • Número 0 • Julio 2007Grupo de Biología del Linfocito. Universidad de Santiago de CompostelaMontserrat Nogueira ÁlvarezDpto. de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Santiago de Compostela.Componentes del grupoMontserrat Nogueira Álvarez; Pilar Árias Cres-po; Francisco J Salgado; Oscar Cordero Santamaría; Ana Canda-Sánchez; Amparo Pérez Díaz; Carla Varela.Historia del grupoNuestras investigaciones comenzaron con los trabajos sobre Protimosina α  (ProT α), un péptido muy acídico (50% de glutámico/aspártico). Su alto grado de conservación filogenética sugería un papel muy importante, describiéndose de hecho a lo largo de estos años funciones tanto intracelulares (división celular) como extracelulares muy dispares. Desde el principio nuestro grupo se centró en las funciones extracelulares, describiendo cómo ProT α aumenta-ba la citotoxicidad de células NK o la proliferación y secreción de IL-2 en PBMC estimulados por PHA. Dentro del estudio de ProT α resultaba también esencial la caracterización del receptor de superficie que daba cuenta de estas funciones extracelulares. Se diseñó un sistema de marcaje radioactivo (125I) para ProT α que permitió identificar dos recepto-res específicos, uno de baja y otro de alta afinidad. Estos receptores eran regulados por el estado de la célula y se internalizaban tras su interacción con ProT α . Experimentos posteriores nos permitieron estimar la masa molecular relativa de las proteínas de unión a ProT α siendo ésta de 31, 29 y 19 kDa. Por otra parte, desde finales de los 90 se empezó a ver que muchas proteínas de señalización celular se encontraban asociadas en la superficie celular a microdominios (rafts lipídicos) de composición sensiblemente diferenciada de su entorno. Nos pre-guntamos si el receptor deProT α se encontraba tam-bién concentrado en estas regiones de membrana. Nuestros resultados indicaron, sin lugar a duda, una fuerte asociación con rafts lipídicos, la formación de agregados tras la unión a su ligando (“cap like structures”) así como la participación activa de los rafts en los procesos de transducción de señales. Es-peramos, en breve, poder aportar más datos acerca este receptor, de los componentes de la cascada de señalización intracelular así como de la estructura primaria de las proteínas que lo constituyen. Aparte de ProT α, CD26 es también objetivo de la investigación farmacéutica y básica. Ectopepti-dasa multifuncional presente en un amplio espectro de células, presenta un papel muy relevante en dia-betes y artritis reumatoide, así como en progresión/agresividad tumoral y obesidad. Su expresión está regulada en linfocitos T se la ha relacionado con el control de la actividad de citoquinas y quimioquinas así como de rutas clave de adhesión y señalización vía integrinas o CD45, respectivamente. Nuestros estudios comenzaron en el año 1997, describiendo un espectacular incremento de CD26 y de su acti-vidad dipeptidil peptidasa IV(DPPIV) en linfocitos T activados, especialmente T CD4+ y CD8+, coesti-mulados con IL-12. A pesar de que en el año 1991 se había descrito coexpresión/interacción de CD26 y CD45R0 en células T de memoria en ese mismo artículo obtuvimos datos que indicaban que IL-12 tenía un efecto totalmente opuesto sobre la expre-sión de ambas moléculas, causando una disminución de la expresión de CD45R0. Este dato fue de notable importancia para investigaciones futuras. En el año 2000 también publicamos que el aumento de expre-sión de CD26 dependiente de IL-12 era debido a procesos postranscripcionales. En 2003 demostramos que CD26 y CD45R0 estaban presentes tanto en fracciones raft como no-raft de células T en reposo y activadas, variando su presencia relativa de acuerdo con las condiciones de activación. Propusimos y demostramos entonces un modelo de interacción de tipo cis dependiente de IL-12, en el cual los mayores niveles de CD26 generados por la citoquina estaban regulando el des-plazamiento de CD45R0 fuera de rafts y, con ello, la actividad fosfatasa de CD45. Además, comenzamos los trabajos con el receptorde IL-12 (IL-12R). IL-12R está formado por dos subunidades (IL-12Rα1 e IL-12Rα2) que carecen de actividad enzimática Proteómica • Número 0 • Julio 2007 intrínseca, por lo que la cascada de transducción de señales es a través de la vía Jak/STAT, en donde Jak2, Tyk2 y STAT4 son componentes esenciales. Por eso, y a raíz de los datos anteriormente comen-tados, nuestro grupo planteó una hipótesis en la cual la salida de CD45R0 (fosfatasa de tirosina) de zona raft tenía como objetivo su acercamiento a Tyk2, una quinasa Janus que interacciona con IL-12Rβ y que es sustrato de CD45. Tyk2 quedaría de esta for-ma defosforilada e inactivada. Todo ello relacionaría a CD26 con un mecanismo de «retroalimentación negativa» para desconectar la señalización desen-cadenada a través de IL-12R. Además, IL-12, como ocurre con otras citoquinas, podría también activar otras vías de señalización aparte de la clásica Jak/STAT, como las MAP quinasas Raf-Mek1-Erk1/2 o la familia Src, lo cual podría relacionarse con el enriquecimiento en rafts de ciertas moléculas de se-ñalización o la inducción de proliferación celular en linfocitos T; estaba claro que para todo ello habría que investigar la topología de IL-12R α 1 e IL-12R α 2 en linfocitos T humanos. Avanzando en esta línea, hemos demostrado recientemente que la IL-12 es capaz de inducir fosfo-rilación y activación de la cascada de MAPK quinasas Raf-Mek1-Erk1/2 y que la activación de estas quinasas es dependiente de la integridad de las regiones raft de membrana plasmática. Estos resultados nos hicieron sospechar que alguna o las dos proteínas (β1β2) que conforman el receptor de IL-12, podrían estar en microdominios raft. De hecho, aparte de analizar mediante geles bidimensionales las especies proteicas de los rafts lipídicos y la influencia de IL-12 sobre esta composición, obtuvimos resultados que nos indicaban que, en ausencia de IL-12, IL-12Rβ2 se encontraba fundamentalmente en zona raft e IL-12Rβ1 en regio-nes no-raft, provocando la presencia de IL-12 una primera señal β2-dependiente y un desplazamiento de IL-12Rβ2 a zonas no raft, en donde podría  asociarse con IL-12Rβ1 y mediar una señal β1β2-dependiente. Todos estos resultados están recogidos en un trabajo pendiente de publicar (“Lipid rafts and how to regulate signalling via IL-12R through protein positioning on cell membrane.”). Aparte de CD45R0, CD26 interacciona con otras proteínas en la superficie como adenosín deaminasa (ectoADA). Una serie de estudios de microscopía confocal fueron diseñados para revelar la posible relación entre IL-12 y otras citoquinas (IL-2, IL-4, TNF) con la expresión, regulación y ubicación en la superficie celular de CD26, ecto-ADA y CD45R0. También estudiamos la influencia de CD26 en la vía de transporte de ADA hacia la superficie celular. Fruto de estos estudios se descubrió que la presen-cia de ecto-ADA era independiente de la actividad del gen, que sus niveles estaban controlados por citoquinas, que ecto-ADA se unía sólo parcialmen-te a CD26 y que CD26 no formaba parte de la vía de secreción del ADA intracelular. Hipotetizamos, además, que ecto-ADA podía estar relacionado en diversos contactos célula-célula. Finalmente, a lo largo de estos años también publicamos diversos trabajos sobre CD26 soluble (sCD26) como biomar-cador. En dos trabajos se estudió el valor potencial diagnóstico y pronóstico de CD26s en pacientes con carcinoma colorectal. El otro se corresponde con una colaboración con el Servicio de Reumatología del Hospital Clínico Universitario de Santiago que se sigue manteniendo hoy en día en la que estudia-mos la presencia de IL-12, IL-15, CD26s y ADA en pacientes con artritis reumatoide. Como prolonga-ción natural de estos estudios hemos puesto a punto un método de análisis de muestras de suero que permite eliminar con volúmenes de partida mayores de lo habitual albúmina e inmunoglobulinas totales. También se está comenzando a analizar, mediante geles bidimensionales, los sueros fraccionados de individuos sanos y de pacientes a los que se les ha diagnosticado recientemente una artritis reumatoide, a la búsqueda de un biomarcador temprano de esta enfermedad.Objetivos científicosComo su propio nombre indica este grupo uti-liza como modelo de trabajo los linfocitos T huma-nos y tiene actualmente dos grandes objetivos. El primero de ellos, encuadrado en lo que podríamos denominar investigación básica, es profundizar en el modelo de mosaico fluido de la membrana bio-lógica, analizando los movimientos laterales de sus distintos componentes (especialmente proteínas y lípidos) así como su segregación en determinados microdominios (“rafts” o balsas lipídicas) en res-puesta a estímulos mediados por el receptor de la célula T (TCR) o receptores de citoquinas y facto-res de crecimiento. Asimismo, este primer objetivo también engloba estudiar si esa segregación puede afectar a la señalización de esos receptores, po-tenciándola, inhibiéndola o modificando de algún modo su funcionalidad. Para ello investigamos me-diante distintas técnicas proteómicas/interactómi-0 Proteómica • Número 0 • Julio 2007cas y de inmunofluorescencia la dinámica de varias moléculas de la superficie del linfocito T (CD26, CD45, IL-12R, receptor de Protimosina α), así como la influencia de las asociaciones transitorias con otros receptores en los procesos de transduc-ción de señales al interior celular. El segundo de los objetivos, en cambio, pertenece más al ámbito de la investigación aplicada, ya que pretende la búsqueda de biomarcadores séricos de detección temprana de artritis reumatoide mediante el uso de distintas estrategias proteómicas.     Proyectos financiados en convocatorias públicas-  Estudio de la actividad citotóxica de linfo-citos activados por IL-2. -  Una aproximación a los mecanismos de modulación de la inmunocapacitación de células T por hormonas tímicas-  Inmunoregulación por protimosina-alfa: mecanismo molecular de acción en células T y estudio preliminar en inmunoterapia adoptiva. -  Activación de la citotoxicidad endógena de células naturales asesinas (NK) humanas por la hormona tímica protimosina-alfa. -  Mecanismo molecular de activación de cé-lulas naturales asesinas (NK) por protimo-sina alfa. Posibilidades terapéuticas. -  Receptor de protimosina alfa: caracteriza-ción estructural y biológica. -  Mecanismo molecular de protimosina alfa como modificador de la respuesta biológi-ca.-  Detección de biomarcadores de artritis reu-matoide mediante técnicas proteómicas.-  Proteínas que interaccionan con CD26 en la membrana plasmática: un estudio proteómi-co y funcional-  Red de Biotecnología aplicada al ámbitode las ciencias de la salud. -  Interacción de proteínas de membrana como nuevo mecanismo de control de receptores de citoquinas.Colaboraciones -  Dr. M.N. Jones, Reader of Biochemistry, Medical School, Manchester University.-  Dr. F. Bell, Professor of Immunology, School of Biological Sciences, Manchester University.-  Dr. A. Magee, Professor of Membrane Bio-logy, Imperial College London, Section of Cell and Molecular Biology.-  Dr. R. Franco y Dra. C. Lluis, del Departa-mento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Barcelona.-  Dr. F. Sánchez-Madrid, Servicio de Inmuno-logía del Hospital de la Princesa, Madrid.-  Dr. J. Rodríguez-Berrocal y Dra. M. Paez de la Cadena, del Departamento de Bioquí-mica y Biología Molecular de la Universi-dad de Vigo.  -  Dr. J. Viñuela y Dr. A. Mera-Varela, del Servicio de Inmunología y del Servicio de Reumatología respectivamente del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Com-postela.-  Jaime Sancho. Instituto de Parasitología y Biomedicina.Consejo Superior de Investi-gaciones Científicas. Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud. Granada   Publicaciones       Se recogen como material suplementario en la publicación “on line”.

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