Abel, A.

Criado, M.T.

Ferreirós, C.

Marzoa, J.

Sánchez, S.

Repositorio Institucional de la Universidad de Córdoba

76 PROTEÓMICA • NÚMERO 1 • FEBRERO 20086. PROTEÓMICA CLÍNICA APLICADAEstudio de la interacción de las porinas PorA y PorB  de Neisseria por incorporación en liposomas  y “Blue Native Electrophoresis”Abel AM, Sánchez S, Marzoa J, Criado MT, Ferreirós C. Dpto. de Microbiología y Parasitología. Facultad de Farmacia. USCIntroducciónEn Neisseria meningitidis las proteínas mayo-ritarias de la membrana externa, las porinas PorA y PorB, son los principales componentes de las actua-les vacunas desarrolladas contra el meningococo de serogrupo B. Hasta la actualidad se ha establecido que ambas porinas poseen una estructura homotrimé-rica y que de forma minoritaria podrían estar forman-do heterotrímeros PorA/PorB. Esta hipótesis está basada en estudios con porinas recombinantes en los que únicamente se utiliza uno de los dos tipos de pro-teínas (Derrick, 1999). En este trabajo se utilizaron de manera conjunta  las dos porinas recombinantes con el fi n de estudiar la interacción entre ambas. El entorno de la membrana externa se simuló mediante su reconstitución e incorporación en liposomas y la caracterización de los complejos formados se llevó a cabo utilizando la denominada “Blue Native Elec-trophoresis” (Shägger y von Jagow, 1991).Material y métodosEl clon de expresión de la porina recombinan-te PorA fue amablemente cedido por el grupo del Dr. Feavers del NIBSC, Reino Unido. La porina recombinante PorB fue cedida por el grupo del Dr. Gorringe de la HPA, Reino Unido. -  Expresión y purifi cación de las proteína recombinante PorA: las células transfor-madas de Escherichia coli conteniendo el plásmido de expresión se hicieron crecer en medio YTX2 con kanamicina. La expresión de la proteína se indujo añadiendo IPTG y se solubilizó con tampón de lisis (urea 8 M, NaH2PO4 0.1 M, Tris-HCl 10 mM pH 8.0 e imidazol 20 mM) y posterior sonicación. Finalmente, la rPorA se purifi có por IMAC (immobilised metal affi nity chromatogra-phy) con una columna de Ni-NTA.-  Renaturalización de las proteínas recombi-nantes por incorporación en liposomas: las láminas lipídicas para la obtención de los liposomas se prepararon en un rotavapor a 25ºC disolviendo en cloroformo L-α-fosfa-tidilcolina y colesterol, en una proporción de 7:2. La incorporación en los liposomas de la rPorA, de la rPorB o de ambas a la vez, se realizó disolviendo la lámina lipí-dica en HEPES 10 mM (pH 7.2) con oc-tyl-β-D-glucopiranosido y la/s proteína/s a una concentración de 1mg ml-1. Las vesícu-las unilaminares se obtuvieron por diálisis frente a PBS con 0.0001% de timerosal y, posterior sonicación. -  Caracterización de los complejos de las po-rinas por electroforesis 2D BN /SDS-PAGE: la primera dimensión en “blue native elec-trophoresis” se llevó a cabo utilizando el sistema de geles NativePAGE™ Novex® Bis-Tris de Invitrogen. La muestra se pre-paró en Bis-Tris 50mM con ácido amino caproico 1M, dodecil-maltosido al 10% y Coomassie® G-250 al 5% y  se cargó en geles con un gradiente de poliacrilamida del 3-12%. Tras el tratamiento a 85ºC de la pri-mera dimensión en tampón de muestra con DTT, la caracterización de los complejos se realizó en SDS-PAGE utilizando un gel del 10% y tinción con Coomassie.ResultadosLos homocomplejos constituidos exclusivamen-te por la porina rPorA son complejos con tres movi-lidades electroforéticas y probablemente originados por la asociación de un número diferente de monó-meros. De igual modo, la asociación de subunida-des de la porina rPorB da lugar a homocomplejos con diferentes movilidades electroforéticas, pero en este caso son dos los tipos de homocomplejos PROTEÓMICA • NÚMERO 1 • FEBRERO 2008 77detectados. Sin embargo, cuando ambas porinas son utilizadas conjuntamente, únicamente se obtiene un tipo de complejo heteromérico (Figura 1). Figura 1. Análisis por 2D BN/SDS-PAGE de los complejos de porinas recombinantes de Neisseria incluidas en liposomas. (a) Caracterización de homocomplejos de rPorA; (b) Caracterización de homocomplejos de rPorB; (c) Análisis de la interacción entre entre la rPoA y la rPorB. Encima de cada gel se muestra la correspondiente primera dimensión por “blue native electrophoresis”. Las imágenes se corresponden a tinciones con Comassie.ConclusionesEl análisis por electroforesis 2D BN/SDS-PAGE de los complejos formados al incluir en liposomas los dos tipos de porinas de Neisseria, permitió com-probar que cuando ambas porinas están presentes en la membrana lipídica, éstas interaccionan para reorganizarse formando únicamente heterocomple-jos PorA/PorB. BibliografíaDerrick J P, Urwin R, Suker J, Feavers IM, et al. 1999. Infection and  Immumity. 67: 2406–2413.Shägger H and von Jagow G. 1991. Analytical Bioche-mistry. 199: 223-231.El gen NcGRA7 codifi ca el antígeno inmunodominante de 17-KDa de Neospora caninumÁlvarez-García G1, Pitarch A2, Fernández-García A1, Zaballos A3, Gil C2, Gómez-Bautista M1, Aguado-Martínez A1, Ortega-Mora L.M1.1 Grupo SALUVET. Departamento de Sanidad Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad Complutense de Madrid, 28040-Madrid, Spain. 2 Departamento de Microbiología II, Facultad de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid, Plaza Ramón y Cajal s/n 28040-Madrid, Spain. 3 Dpto. de Inmunología y Oncología. Centro Nacional de Biotecnología. U.A.M. Campus de Cantoblanco. 28049. Madrid. Spain.IntroducciónLa fracción antigénica de 17-19 kDa (p17) de Neospora caninum es el principal antígeno inmu-nodominante reconocido por sueros de bovinos infectados naturalmente con N. caninum en geles de poliacrilamida unidimensionales (SDS-PAGE) (Álvarez-García et al., 2002). Material y métodos y resultadosCon el objetivo de identifi car las proteínas que componen la fracción p17, en primer lugar, se construyó una genoteca de cDNA de taquizoítos de N. caninum la cual, posteriormente, se enfren-tó a un anticuerpo purifi cado por afi nidad que reconocía la fracción p17 (APA17). Se aislaron varios clones de cDNA cuya secuencia presentó un 100% de identidad con el gen NcGRA7que codifi ca la proteína NcGRA7 de 33 kDa (Lally et al., 1997). A continuación se realizó un abordaje proteómico en el cual se combinó la electroforesis en geles bidimensionales de poliacrilamida (2D-PAGE), el western blot y la espectrometría de masas con la fi nalidad de caracterizar la fracción p17. Tanto el anticuerpo APA17 como los sueros 

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