Bramley, Peter M.

Fraser, Paul D.

Guerrish, C.

Halket, J.M.

Mora, L.

Patel, R.K.

Santandreu, M.A.

Repositorio Institucional de la Universidad de Córdoba

PROTEÓMICA • NÚMERO 1 • FEBRERO 2008 105Marcadores peptídicos para determinar el origen animal en productos cárnicos procesadosSentandreu MAa, Mora Lb, Gerrish Ca, Halket JMa, Patel RKa, Fraser PDa, Bramley PMa.a Centre for Chemical and Bioanalytical Sciences, Royal Holloway, University of London, Egham TW20 0EX, U.K. b Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (CSIC), P.O. Box 73, 46100 Burjassot, Valencia, SpainIntroducciónPara la mayoría de los alimentos existe una obli-gación legal de etiquetar los distintos constituyentes contenidos en ellos, con el fi n de que el consumidor tenga información objetiva sobre los productos que compra. Para cumplir con este objetivo es necesario disponer de métodos de análisis robustos, precisos y sensibles. Los métodos de detección de ADN que se emplean normalmente para este propósito suelen ser poco fi ables y precisos cuando se emplean en el análisis de alimentos procesados. Las modernas técnicas de proteómica empleando la espectrometría de masas pueden ser una alternativa sólida en la identifi cación del origen animal de los productos cárnicos cocinados. Material y métodos100 g de carne de pollo y otros tantos de carne de cerdo se cocinaron en un horno a 200 ºC. Poste-riormente se picaron las carnes y se homogeneizaron separadamente con 10 mL de tampón Tris, pH 8.0. El homogenado se centrifugó (20 min a 10000 rpm, 4ºC), recogiendo el precipitado y solubilizándolo en el tampón Tris pH 8.0 conteniendo 6M de urea y 1 M de tiourea. Se añadió la cantidad necesaria del extracto de pollo en el extracto de carne para obtener un extracto mixto de carne de cerdo conte-niendo un 1 % de proteínas de pollo. 2,5 mg de este extracto mixto se fraccionaron por isoelectroenfo-que en el intervalo de pH 4-7. Las proteínas de las fracciones obtenidas se separaron en SDS-PAGE, recortando la banda correspondiente a la isoforma 3 de la cadena ligera de miosina (MLC-3) para hi-drolizarla posteriormente con tripsina. Después de desalar las muestras con puntas Zip-tip, 1,5 µL de cada muestra se depositaron en una placa MALDI, añadiendo a continuación el mismo volumen de una solución de ácido 2,5-dihidroxibenzoico. Una vez secas, las muestras se analizaron empleando un espectrómetro de masas MALDI-TOF Refl ex III (Bruker Daltonics). 4 2288.7742561.818 2675.964 2759.861 2864.8422375.80809-11-07offgel9 (2)\0_G2\1\1SRef01234x10Intens. [a.u.] A4 2331.6532804.7232288.6922500.75709-11-07offgel10(2)\0_H1\1\1SRef0246x10Intens. [a.u.]B2288.8752483.9842331.8392804.020Band 1 bis (1% chicken)\0_C1\1\1SRef012344x10Intens. [a.u.]C02300 2400 2500 2600 2700 2800 2900 3000m/zFigura 1: Espectros de masas MALDI-TOF de las digestiones con tripsina de MLC-3 obtenidas para: A) cerdo 100 %, B) pollo 100 % y C) 1% de pollo en un extracto de cerdo. La fl echa blanca indica el péptido seleccionado como biomarcador para detectar la carne de pollo. ResultadosEste trabajo se desarrolló elaborando un extracto mixto de carne conteniendo un 1 % de proteínas de pollo contaminando el extracto de carne de cerdo. El enriquecimiento de las proteínas de pollo emplean-do isoelectroenfoque y SDS-PAGE es una etapa crucial para poder identifi car marcadores peptídicos específi cos con capacidad para detectar la presencia de carne de pollo en productos cárnicos de cerdo. La Figura 1 muestra el análisis por espectrometría de masas MALDI-TOF de la fracción enriquecida en MLC-3 de pollo del extracto mixto y digerida pos-teriormente con tripsina. El estudio detallado de los péptidos específi cos de la MLC-3 de pollo permitió identifi car el péptido HVLATLGEKMTEEEVEEL-MK (M+H+ 2332, correspondiente a la forma mono-oxidada) como un buen biomarcador de la presencia de pollo en productos cárnicos cocinados, aún en concentraciones tan bajas como el 1%. 106 PROTEÓMICA • NÚMERO 1 • FEBRERO 2008ConclusionesLa proteómica supone una alternativa robusta y precisa para detectar la presencia de distintas es-pecies animales en productos cárnicos cocinados, superando las limitaciones que los métodos de de-tección de ADN presentan actualmente en alimentos procesados.Determinación y validación de dianas implicadas en la carcinogénesis del osteosarcoma infantil mediante plataformas de genómica y proteómicaZalacain M, Folio C, Corrales FJ, Mora MI, Sierrasesúmaga L, Toledo G, Patiño-García A.IntroducciónEl osteosarcoma es el tumor óseo más frecuen-temente diagnosticado en la infancia y adolescencia. La tasa de supervivencia con la quimioterapia dispo-nible en la actualidad se sitúa en 70%, únicamente limitada en aquellos pacientes con tumores metastá-sicos o quimiorresistentes (Picci, 2007). Material y métodosSe han aislado osteoblastos normales y tu-morales de 5 pacientes afectos de osteosarcoma. Los análisis comparativos de sus proteomas se realizaron mediante DIGE (150µg proteína/gel). Los análisis de imagen se realizaron con Decyder y las bandas diferenciales se localizaron en geles bidimensionales preparativos (400µg proteína/gel) que se tiñeron con SYPRO-Ruby y se cortaron para su identifi cación. Se realizó digestión en gel con tripsina y los péptidos resultantes se analiza-ron mediante MALDI-TOF-MS y nanoLC-ESI-MS/MS para identifi car las proteínas utilizando los motores de búsqueda Proteinlynx Global Server y Phenyx. Las proteínas, identifi cadas en Swissprot, se validaron mediante IHQ en un TMA (tissue mi-croarray) compuesto por 233 puntos de tejido (46 pacientes): hueso normal (17,2%), osteosarcomas primarios (37,3%), recidivas (10,1%) y metástasis (35,4%). ResultadosSe han identifi cado 58 puntos proteicos diferen-cialmente expresados, de las que se han obtenido 27 identifi caciones. Las proteínas con mayores diferen-cias entre hueso normal y osteosarcoma se cotejaron con una lista de genes obtenida de la comparación de los mismos tejidos mediante el array de expre-sión GeneChip/HG-U133A (Affymetrix). Entre otras, las siguientes dianas eran comunes en ambos estudios: CRYAB (Incrementada en osteosarcoma, I), HEBP1 (disminuida, D), hnRNH1 (D), PCBP1 (D), EZRI (D), FSCN (D) y LMNA (D). Se ha va-lidado en TMA la proteína CRYAB detectándose, no sólo un incremento signifi cativo en los tumores (p<0.01), sino un incremento progresivo en estadíos avanzados de la enfermedad; tumores primarios vs metástasis vs recidivas (p=0,011). ConclusionesEl estudio comparativo mediante plataformas de genómica y proteómica y la validación en sistemas de alto rendimiento es un método útil para deter-minar dianas implicadas en patologías infrecuentes y de muestra escasa y de difícil acceso, como el osteosarcoma infantil. BibliografíaPicci P. Osteosarcoma (Osteogenic sarcoma). 2007. Orphanet Journal of Rare Diseases;2:6.

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