Brini, F.

Irar, S.

Masmoudi, K.

Pagés, M.

Repositorio Institucional de la Universidad de Córdoba

PROTEÓMICA • NÚMERO 1 • FEBRERO 2008 67dada la hipersensibilidad de las plantas mutantes, son de esperar mayores diferencias en ambos pro-teomas. Así mismo es una herramienta útil para el análisis de diferentes mutantes, defi cientes en dis-tintas enzimas que median la transferencia de poder reductor del NADPH a los peróxidos, disponibles en nuestro grupo con objeto de identifi car posibles rutas de destoxifi cación dependientes de NTRC.BibliografíaApel K, Hirt H. 2004. Annual Review of Plant Biology 55: 373-399.Dietz K-J. 2003. Annual Review of Plant Biology 54: 93-107.Pérez-Ruiz JM, Spinola MC, Kirchsteiger K, Moreno J, Sahrawy M, Cejudo FJ. (2006). The Plant Cell 18: 2356-2368.Figura 1. Análisis proteómico comparativo del estroma de plantas silvestres y defi cientes en NTRC. BAWtCol0 NTRC-KO3 310 10C100 -55 -39 -30 -20 -7 -110161922792348Serrato AJ, Pérez-Ruiz JM, Spinola MC, Cejudo FJ. (2004). Journal of Biological Chemistry 279: 43821-43827.2DE vs cromatografía líquida ProteomeLab PF 2DE en embrión de trigoIrar S1, Brini F2, Masmoudi K2, Pagès M1 (1) Servicio de Proteómica del CRAG, Av Jordi Girona, 18-26 , 08034 Barcelona. (2) Unidad de genética Molecular de plantas , Centro de Biotecnología de Sfax , Sidi Manssur Km6 3038. Sfax –Túnez Introducción Los avances tanto en la separación líquida de proteínas como los realizados en los sistemas de detección de proteínas han permitido desarrollar otras ideas para la separación de proteínas en dos dimensiones, este es el caso de la casa Beckman Coulter y su apuesta por un sistema de separación en dos dimensiones, acoplando a una cromatografía en gradiente de pH una segunda separación basada en la hidrofobicidad de las proteínas. (Wall, D. B., et al., 2000) (Wall, D. B., et al., 2001) (Wang, H., et al., 2002). La elección de una metodología es crítica a la hora de estudiar mezclas complejas de proteínas como demostraremos en esta comunicación. Parti-endo de una misma muestra, en este caso embrión maduro de trigo, hemos separado extractos totales de proteínas utilizando métodos convencionales 2DE y sistemas de cromatografía líquida (ProteomeLab PF 2DE) ( Andrea, P., et al., 2006). Nuestros resultados indican que ambas metodologías son complemen-tarias y nos ayudan a tener una visión más amplia del Proteoma.Material y métodosComo material vegetal utilizamos embriones de trigo, (Triticum derum Desf.) de la variedad Oum Rabiaa, variedad tolerante a sal y sequía. Los em-briones maduros se separan del endospermo. En mortero con nitrógeno líquido se trituran y se guar-dan hasta la extracción de proteínas a -80ºC. (Brini, F., et al, 2007)-  Extracción de proteínas para estudios 2DE: 150 mg de embriones de trigo se resuspen-den en 1,2 ml de Tampón de lisis. (7 M Urea, 2 M Tiourea, 18 mM TrisHCl pH 8.0, 4% CHAPS, 1% Tritón X-100, suplemen-tado con cóctel de inhibidores de proteasas, DNasa y RNasa). Se incuba 20 min a 4ºC. Se añade DTT 14 mM. Las muestras se cen-68 PROTEÓMICA • NÚMERO 1 • FEBRERO 2008trifugan a 35000g durante 10 min a 4ºC.  Se separa el sobrenadante y se cuantifi ca con BCA protein assay reagent kit (Pierce).-  Extracción de proteínas para ProteomeLab PF 2DE: 150 mg de embriones de trigo se resuspenden en 1,2 ml de tampón de lisis. (6 M Urea, 2 M Tiourea, 10% Glicerol,  50 mM TrisHCl pH 8.0, 2% octal-β-D-glu-copyranoside, suplementado con cóctel de inhibidores de proteasas, DNasa y RNasa). Las muestras se centrifugan a 35000g du-rante 10 min a 4ºC.  Se separa el sobrena-dante y se cuantifi ca con BCA protein assay reagent kit (Pierce). A continuación se cam-bia el tampón de la muestra con columnas PD-10 (ProteomeLab PF 2DE kit, Beckman Coulter).-  Separación 2DE y separación mediante ProteomeLab PF 2DE: La separación 2DE se realizó siguiendo las indicaciones de ( Irar. S., et al 2006) y la separación con Pro-teomeLab PF 2DE se realizó atendiendo a (Mónica, S., et al, 2005) modifi cando el tampón de lisis, no utilizamos TCEP y la cantidad inicial de proteínas que inyecta-mos fue de 2.5 mg. Resultados y conclusionesConcluimos que la cromatografía líquida es más resolutiva a pI ácidos y básicos que la 2DE. Así mismo, la 2DE es más resolutiva a pI entre 5.0-6.5. La segunda conclusión que sacamos es que el número de proteínas que se resuelve por ambos métodos es similar. Esto signifi ca que ambas meto-dologías amplían la comprensión del proteoma de una muestra.BibliografíaAndrea, P., Giovana, V., Aliosha, M., Nelson, M., J. Chromatogr. B 2006, 833, 91-100.Brini, F.,  et al., Plant Science, 2007, 172, 20-28 Irar, S., et al., Proteomics, 2006, 6, S175-S185Mónica, S., Cecilia, S., Cristina, V., Fulvio, M., Vanes-sa, P., et al, Proteomics, 2005, 5, 2641-2647. Wall, D. B., Kachman, M. T., Gong, S., Hinderer, R. et al., Anal. Chem. 2000, 72, 1099-1111. Wall, D. B., Parus, S. J., Lubman, D. M.,  J. Chromatogr. B 2001, 763, 139-196. Wang, H., Kachman, M. T., Schwartz, D. R., et al., Electrephoresis 2002, 23, 3168-3181. Identificación de dianas de S-nitrosilación durante la interacción planta-patógenoMaldonado-Alconada AM1, Ogueta-Villareal S2, Martínez-Acedo P3, Martínez-Ruiz A4, Vazquez J3, Jorrín-Novo JV.11Grupo de Bioquímica y Proteómica Vegetal y Agrícola, Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba; 2Unidad de Proteómica. Servicio Central de Apoyo a la Investigación. Universidad de Córdoba; 3Laboratorio de Química de Proteínas y Proteómica, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, CSIC-UAM, Madrid; 4Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, CNIC, MadridIntroducción El óxido nítrico es una molécula esencial en la regulación de numerosos procesos fi siológicos ve-getales; concretamente, desempeña un papel crucial durante la señalización en las respuestas de defensa frente a patógenos y ejerce su papel principalmente a través de la modifi cación reversible de los grupos tioles de cisteínas (S-nitrosilación) (Delledonne, 2005). La identifi cación de las dianas de S-nitro-silación y de los residuos específi cos impliados es un paso previo indispensable para conocer los me-canismos por los cuales esta molécula regula la activación de las respuestas de defensa en plantas. Con este objetivo se ha llevado a cabo el presente 

2DE vs cromatografía líquida ProteomeLab PF 2DE en embrión de trigo

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