Cejudo, F.J.

González, M.C.

Repositorio Institucional de la Universidad de Córdoba

66 PROTEÓMICA • NÚMERO 1 • FEBRERO 2008Estudio  proteómico comparativo del estroma de plantas de Arabidopsis silvestres y defi cientes en NADPH tiorredoxina reductasa cloroplástica (NTRC)González M.C. y Cejudo F.J.Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Universidad de Sevilla y CSIC).  Avda. Americo Vespucio 49, 41092-Sevilla.IntroducciónLa conversión fotosintética de energía lumínica en el cloroplasto genera especies reactivas de oxíge-no. Una de dichas especies, el peróxido de hidrógeno, juega un papel importante como molécula señalizado-ra, pero debido a su conversión en radicales hidroxilo altamente reactivos es tóxica en concentraciones ele-vadas (Apel y Hirt, 2004). El  peróxido de hidrógeno es fundamentalmente  destoxifi cado en el cloroplasto por medio de la ascorbato peroxidasa. Además, las peroxirredoxinas juegan un papel importante en la reducción de peróxidos de hidrógeno (Dietz, 2003), siendo reducidas por tiorredoxinas con electrones procedentes del fl ujo fotosintético. Nuestro grupo ha identifi cado un nuevo tipo de NADPH tiorredoxina reductasa, NTRC,  con un dominio tiorredoxina en el extremo C-terminal y localización cloroplastídica, capaz de reducir efi cientemente una 2-Cys-peroxirre-doxina cloroplástica en un sistema reconstituido in vitro (Serrato et al., 2004). Mutantes knock-out para NTRC de Arabidopsis muestran hipersensibilidad a estrés oxidativo, sugiriendo que esta enzima puede jugar un papel importante en la protección de la plan-ta frente a este tipo de estrés (Pérez-Ruiz et al., 2006). Con objeto de profundizar en el papel desempeñado por NTRC, se ha llevado a cabo un análisis proteó-mico comparativo de plantas silvestres y mutantes defi cientes en NTRC de Arabidopsis.Materiales y métodosNuestro análisis se basa fundamentalmente en la preparación de fracciones estromáticas de cloroplas-tos, y electroforesis bidimensional e identifi cación de proteínas mediante espectrometría de masas. Para ello, se ha puesto a punto un método de aislamiento de cloroplastos intactos y rotura controlada en tampón hipo-osmótico. Las proteínas del estroma se sometie-ron a isoelectroenfoque en tiras de pH 3-10 no lineales y separación en geles de poliacrilamida. Finalmente, se tiñeron con plata o SyproRuby, identifi cándose los spots de interés mediante análisis MALDI-TOF.ResultadosEl análisis del proteoma estromático en plantas de Arabidopsis silvestres y mutantes crecidas en día lar-go mostró algunas diferencias de expresión de proteí-nas en ambos fondos, si bien el fenotipo de las plantas crecidas tanto en día largo (Figura. 1A) como en día corto (Figura 1 B) sugería la existencia de diferencias más drásticas. Las proteínas que se expresaban dife-rencialmente en uno u otro fondo genético se anali-zaron mediante espectrometría de masas, permitiendo identifi car proteínas implicadas en diversas funciones celulares. En un experimento típico (Figura 1C), 25 proteínas mostraron expresión diferencial, identifi -cándose 11 de ellas mediante MALDI-TOF. Entre éstas cabe destacar proteínas del ciclo de Calvin y el Ciclo Oxidativo de las Pentosas Fosfato, como la Ru-bisco activasa (spots 2, 3 y 16) y la fructosa bifosfato aldolasa (spot 22). Otro grupo de spots corresponde a proteínas del fotosistema II, incluyendo la proteína de 23kDa del Oxygen Evolving Complex (7, 8) y la PSBP (Oxygen-Evolving Enhancer protein 2, calcium ion binding; spot 9). Finalmente se han identifi cado proteínas implicadas en el plegado proteíco (Peptidil isomerasa ROC4, spot 10) y de interacción con RNA y DNA (spots 4 y 19). Fenotipo de plantas silvestres (izquierda A, B) y defi cientes en NTRC (derecha A, B) crecidas en condiciones de día largo (A) y corto (B). Las pro-teínas del estroma se sometieron a electroforesis bi-dimensional y tinción con plata (C) identifi cándose los spots señalados expresados diferencialmente en el fondo silvestre (cuadrado azul) o mutante (círculo rojo) mediante MALDI-TOF.ConclusionesSi bien el proteoma estromático de plantas sil-vestres y defi cientes en NTRC no muestra dife-rencias drásticas en las condiciones analizadas, el método puesto a punto en el laboratorio permitirá estudiar condiciones de estrés oxidativo en las que, PROTEÓMICA • NÚMERO 1 • FEBRERO 2008 67dada la hipersensibilidad de las plantas mutantes, son de esperar mayores diferencias en ambos pro-teomas. Así mismo es una herramienta útil para el análisis de diferentes mutantes, defi cientes en dis-tintas enzimas que median la transferencia de poder reductor del NADPH a los peróxidos, disponibles en nuestro grupo con objeto de identifi car posibles rutas de destoxifi cación dependientes de NTRC.BibliografíaApel K, Hirt H. 2004. Annual Review of Plant Biology 55: 373-399.Dietz K-J. 2003. Annual Review of Plant Biology 54: 93-107.Pérez-Ruiz JM, Spinola MC, Kirchsteiger K, Moreno J, Sahrawy M, Cejudo FJ. (2006). The Plant Cell 18: 2356-2368.Figura 1. Análisis proteómico comparativo del estroma de plantas silvestres y defi cientes en NTRC. BAWtCol0 NTRC-KO3 310 10C100 -55 -39 -30 -20 -7 -110161922792348Serrato AJ, Pérez-Ruiz JM, Spinola MC, Cejudo FJ. (2004). Journal of Biological Chemistry 279: 43821-43827.2DE vs cromatografía líquida ProteomeLab PF 2DE en embrión de trigoIrar S1, Brini F2, Masmoudi K2, Pagès M1 (1) Servicio de Proteómica del CRAG, Av Jordi Girona, 18-26 , 08034 Barcelona. (2) Unidad de genética Molecular de plantas , Centro de Biotecnología de Sfax , Sidi Manssur Km6 3038. Sfax –Túnez Introducción Los avances tanto en la separación líquida de proteínas como los realizados en los sistemas de detección de proteínas han permitido desarrollar otras ideas para la separación de proteínas en dos dimensiones, este es el caso de la casa Beckman Coulter y su apuesta por un sistema de separación en dos dimensiones, acoplando a una cromatografía en gradiente de pH una segunda separación basada en la hidrofobicidad de las proteínas. (Wall, D. B., et al., 2000) (Wall, D. B., et al., 2001) (Wang, H., et al., 2002). La elección de una metodología es crítica a la hora de estudiar mezclas complejas de proteínas como demostraremos en esta comunicación. Parti-endo de una misma muestra, en este caso embrión maduro de trigo, hemos separado extractos totales de proteínas utilizando métodos convencionales 2DE y sistemas de cromatografía líquida (ProteomeLab PF 2DE) ( Andrea, P., et al., 2006). Nuestros resultados indican que ambas metodologías son complemen-tarias y nos ayudan a tener una visión más amplia del Proteoma.Material y métodosComo material vegetal utilizamos embriones de trigo, (Triticum derum Desf.) de la variedad Oum Rabiaa, variedad tolerante a sal y sequía. Los em-briones maduros se separan del endospermo. En mortero con nitrógeno líquido se trituran y se guar-dan hasta la extracción de proteínas a -80ºC. (Brini, F., et al, 2007)-  Extracción de proteínas para estudios 2DE: 150 mg de embriones de trigo se resuspen-den en 1,2 ml de Tampón de lisis. (7 M Urea, 2 M Tiourea, 18 mM TrisHCl pH 8.0, 4% CHAPS, 1% Tritón X-100, suplemen-tado con cóctel de inhibidores de proteasas, DNasa y RNasa). Se incuba 20 min a 4ºC. Se añade DTT 14 mM. Las muestras se cen-

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