We present a relatively simple methodology for the detection of microsatellite sequences in partial genetic libraries in plasmids, consisting mainly in a new DNA extraction protocol and the use of a probe (TG)7T to locate different types of microsatellites.Se presenta una metodología relativamente sencilla para la detección de secuencias microsatélites a partir de genotecas parciales en plásmidos, que consiste fundamentalmente en un nuevo protocolo de extracción de DNA y el empleo de una sonda (TG)7T para localizar diferentes tipos de microsatélites

Andrés Cara, D.F. de

Dorado, G.

Garrido, Juan J.

Vega-Pla, J.L.

Archivos de Zootecnia

Repositorio Institucional de la Universidad de Córdoba

PROPUESTA DE METODOLOGÍA PARA LA LOCALIZACIÓN DEMICROSATÉLITES EN EL GENOMA EQUINOMETHODOLOGY PROPOSAL FOR THE LOCATION OF MICROSATELLITES IN THE EQUINE GENOMEVega-Pla, J.L.1, D.F. De Andrés Cara2, J.J.Garrido Pavón2 y G. Dorado31Laboratorio de Grupos Sanguíneos. Servicio de Cría Caballar. Apartado Oficial Sucursal 2. 14071-Córdoba. España.2Unidad Mixta CSIC-UCO Marcadores Genéticos Moleculares. Facultad de Veterinaria. Avda. MedinaAzahara 9. 14005 Córdoba. España.3Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Universidad de Córdoba. Avda. Medina Azahara 9.14005 Córdoba. España.Arch. Zootec. 48: 189-194. 1998.COMUNICACIÓNbasan en la selección de individuosque transmitan unos caracteres pro-ductivos muy concretos, lo que a me-dio o largo plazo, implica un aumentode la consanguinidad y, por lo tanto,una mayor homogeneidad genética dela raza. Este fenómeno dificulta cadavez más la identificación de los indivi-duos y el control de su genealogía, porlo que se hace necesario definir nue-vos marcadores que detecten las cadavez menores variaciones entre losejemplares de una misma familia, ga-nadería o grupo racial.Para la obtención de nuevos marca-dores genéticos resulta muy útil abor-dar el estudio de la información queposeen las células de un individuodirectamente, sobre los ácidos nu-cleicos, y no sólo su expresión en for-ma de proteínas.RESUMENSe presenta una metodología relativamentesencilla para la detección de secuenciasmicrosatélites a partir de genotecas parciales enplásmidos, que consiste fundamentalmente enun nuevo protocolo de extracción de DNA y elempleo de una sonda (TG)7T para localizar dife-rentes tipos de microsatélites.SUMMARYWe present a relatively simple methodologyfor the detection of microsatellite sequences inpartial genetic libraries in plasmids, consistingmainly in a new DNA extraction protocol and theuse of a probe (TG)7T to locate different types ofmicrosatellites.INTRODUCCIÓNLos métodos de mejora animal sePALABRAS CLAVE ADICIONALESMarcadores genéticos. Extracción de DNA.Genoteca.ADDITIONAL KEYWORDSGenetic markers. DNA extraction. Geneticlibrary.Archivos de zootecnia vol. 48, núm. 178-179, p. 190.VEGA-PLA ET AL.Los estudios sobre el DNA hanpuesto de manifiesto en el genomahumano unas secuencias muy peculia-res denominadas microsatélites (Tautz1989). Se trata de repeticiones en tán-dem de motivos simples, así (TG)ndonde 10<n<30. La función que tie-nen, así como su mecanismo de ac-ción, son poco conocidos.Los microsatélites presentan una-serie de características:Son muy frecuentes y están reparti-dos por todo el genoma eucariótico y,a menudo, presentando un alto gradode polimorfismo en cuanto al númerode repeticiones de la secuencia(Stallings et al., 1991).El modelo de herencia es men-deliano y los alelos detectados presen-tan codominancia. No se ha encontra-do en la bibliografía ejemplo algunode herencia no mendeliana de ningúnmicrosatélite.Las técnicas empleadas para la de-tección de la variabilidad son muysimples en comparación con otras téc-nicas de investigación del polimor-fismo del DNA.Se necesitan cantidades muy pe-queñas de material biológico para ladeterminación de las variantes alélicas,incluso aunque el DNA esté bastantedegradado, lo que permite el estudiode muestras muy antiguas y de origendiverso.Estas características han llevado aconsiderar a los microsatélites comolos marcadores de elección para con-seguir, no sólo un modo fiable de iden-tificación individual y de control delas genealogías, sino también una me-jor apreciación y caracterización de ladiversidad genética de las razas(Moazami-Goudarzi et al., 1994).La estrategia más empleada para ladetección de microsatélites equinosconsiste en construir en plásmidos unagenoteca parcial de fragmentos deDNA inferiores a 1000 pb y explorarlacon sondas de motivos dinucleotídicosrepetidos (Ellegren et al., 1992,Marklund et al., 1994, Guérin et al.,1994).El objetivo de este estudio es lapresentación de una metodología sen-cilla que permite la detección de se-cuencias de DNA conteniendo seg-mentos repetitivos en tándem (micro-satélites) de motivos dinucleotídicosT-G para su empleo en las pruebas deidentificación y control de paternidadequinos y en la confección de mapasgenéticos.MATERIAL Y MÉTODOSSe extrae y purifica el DNA de 30muestras de sangre de caballos. Seopta por combinar las técnicas descri-tas por Grobet et al. (1991) y Miller etal. (1988) (tabla I). Una vez comple-tamente solubilizado el DNA, se cal-cula la concentración obtenida y sugrado de pureza.Siguiendo la técnica de Estoup etal. (1993) se selecciona la enzimaSau3A1 y se realiza una digestión com-pleta de 25 mg de DNA genómico.Se separan los fragmentos del DNAdigerido por electroforesis en un gelde agarosa al 1 p.100 (p/v), utilizandocomo referencia de tamaños el plás-mido pBR322 digerido con HaeIII.Una vez que la separación es suficien-te para discriminar 200 pb, se detienela electroforesis y se recorta la porciónde agarosa que contiene el DNA deArchivos de zootecnia vol. 48, núm. 178-179, p. 191.DETECCIÓN DE MICROSATÉLITES EN DNA EQUINOTabla I.  Protocolo de extracción de DNA genómico a partir de sangre entera. (Extraction ofgenomic DNA from whole blood).MATERIAL- TE 10:1: Tris HCl 10 mM, pH 7,5; EDTA 1 mM, pH8- Solución de homogeneización: urea 8 M; NaCl 0,3 M; SDS 2 p.100 (p/v); Tris HCI 10 mM, pH 8,5; EDTA10 mM, pH 8- NaCI 6 M- Etanol absolutoMÉTODO1. Centrifugar 7 ml de sangre con anticoagulante a 900 g durante 10 min a 4°C.2. Recoger todo el manto leucocitario en un volumen final de 1 ml y almacenar a -20°C hasta su uso.3. Descongelar la muestra y añadir 50 ml de TE.4.  Agitar 10 min a 150 rpm, centrifugar a 900 g durante 10 min a 4°C y eliminar el sobrenadante.  Repetirel lavado dos veces más.5. Tras el último lavado, resuspender el botón celular en 15 ml de solución de homogeneización y agitara 150 rpm durante 1 h 30 min.6. Añadir 3 ml de NaCI 6 M, agitar invirtiendo durante 15 seg y centrifugar 15 min a 900 g y 4°C.7. Recuperar el sobrenadante, añadir dos volúmenes (35 ml) de etanol absoluto. El DNA se precipita enforma de maraña de filamentos o medusa.  Recuperar dicha medusa con una pipeta Pasteur con la puntasellada.8. Lavar el material recuperado adherido a la pipeta en etanol al 70 p.100.9. Secar ligeramente al aire e introducir en un microtubo con 1 ml de TE hasta que se desprenda elcoágulo de la pipeta.10. Agitar suavemente (rueda) de varias horas a varios días hasta disolución completa.talla comprendida entre aproximada-mente 200 y 400 pb, se extrae el DNA,se cuantifica y se inserta en un plásmidopUC18 digerido con BamH1 y desfos-forilado.Se preparan células competentes E.coli JM105 siguiendo el protocolo delDr. Mike Scott del Departamento deNeurología de la Universidad deCalifornia en San Francisco (Vega Pla,1996) basado en resiembras sucesivasen cultivos en medios líquidos y lautilización del CaCl2 como agentepermeabilizador de la membrana. Setransforman con 10 ng de vectorrecombinante. Una vez que se disponede las colonias de bacterias suficiente-mente crecidas (1-2 mm) sobre lascajas de LB-agar selectivo, se trans-fieren las colonias y se fija el DNA delas mismas a una membrana de nailon.La sonda que se utiliza para la de-tección de clones portadores demicrosatélites es un oligonucleótido(TG)7T marcado en el extremo 3' conDigoxigeninaÒ. Se rastrea la mem-brana de nailon con la sonda y seidentifican las colonias positivas me-diante un anticuerpo anti-Digoxigeninaque lleva unida una fosfatasa alcalina,quien al actuar sobre el sustrato ade-cuado (Lumigen PPD), produce unaArchivos de zootecnia vol. 48, núm. 178-179, p. 192.VEGA-PLA ET AL.Tabla II. Secuencias de los fragmentos de DNA con microsatéliles (5'-3' ). (DNA sequences withmicrosatellites).Microsatélite: HLM1 Número de acceso GenBank: U36493 Tamaño: 250 pbGATCTAGAGGACGGGAGCAGCGGGGGCGGAAGAGTAGGCTCCGTGGCCCGGGGGTTGAGAACTGTTTTGCAGCAGCTCTGCACGCCCCCTCCCCGCCCCGCGACAGAGACACGTGTTGTGGTTCCGTCCCGGCTAAGCGATTGTGTGTGTGTGTGTGTAGGGTAGGATCGCGCTTTTTTTTCCTTTGCTGTGGGTAAGGCTTCTGGGTCCAGAGCCCCAGGGGGAGCACTCCTTCGGCCGGCACCCGGATCMicrosatélite: HLM2 Número de acceso GenBank: U36494 Tamaño: 150 pbGATCTCTCTCCCCACCTCCCCATCTCCCAACCCCCATCCCGGCCCTCGCTCCTCCTCTCCACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAGCCTGACACAATGGCCGGGTGGGGCTGAGGAACTGGCTTCCTCTGCGGCGATCMicrosatélite: HLM3 Número de acceso GenBank: U36495 Tamaño: 468 pbGATCTAGAGGACCATTCTCTGGGCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCACACGCACGTGTGTGTGGGGAGGGTTTGAGGTGGGTGCAGAAAAACCAAGGGGTTCTAGCCCTCCTTTTCTACCTTCCCAGGGCAATATCTCCTGCAGAAACTGAATCTCCTCCATGGCTCCAGCTCCACCAGACAGGCCCCACTCTGGTTCCAGCTTCTCCAGAATCTCCTGCCCTGAATTCCAGGACACTACCTCCTCCCGCTGTCTCTGAGGTCTAGGAGTGGTAGTGGCTTCCTTCTGTTGCTGTTCTCTGTGGTGCCTCACCATCTCCTGTTTGGCTGAGCTCAGGAATTCGAATTATGCTCCAAGAGAACTGCAGACGTTTCCCCACTTACGTTGTTTCTACTTATGATTTAGCGACCTTACGATGGTGTGAAGGTAATATGCATTCAGTAGCAACTTTACTTCAAATTTGGATCMicrosatélite: HLM4 Número de acceso GenBank:  U36496 Tamaño: 362 pbGATCCCATGAATGGGCTCCAGAGAACCCTGGAAAGCCCACGCACCTGCGGAAGCCACCGTCGTCAAAGAAAGGCAGCCTCAGTTCCCAAAACAGAAGGAGCCGAGTGGAAAGACTGCGTAGGAGTGCCGTGGGGAGACACTCAAGCTCATGAGTCTCCAGCCTTTTCGAGAAGAAAAGCCCCTTTCCATTTCCTCGGGGATGGGTGCAAGGTGCCCTGAAGAGCTCGCGAGTGTGTGTGTGTGTGCTGTGGGGTCGTCTTTGTACTGTGACGGTTGTGAGTCTCGGGCAGCACCGTGGCTGCCTCCCCTCCCTGGGGGAGTCCCAAGGCTCCAAAGAGGCTGCGATGTTAGGCTTAGAGATCMicrosatélite: HLM5 Número de acceso GenBank: U36497 Tamaño: 425 pbGATCCAGAATGACTCCCAGTGGGAGGTGGTTCTTCTGTTGACCTGGCTCCCTTGGTGGTCTGAGGTTGTCACCCTCAGGGCTGAATTTGTGAGCAGTGTGTGTGTGTGTGTGTGCACGAGTCTGTGTGTGTGTGTGCACACATGCTCAACTGGAGACCCACAGGATTTCAGCTCTTCTGAGGCACCTAGAAGCTGACACGCTGGGTAGTGAGACGAGCAGCCGGGTGAGAATGTAACAAACGTTGTATGAAAGAAATCGACTTTGTTACCGACTGGCTTGAGGGAGGGACGACTGTGTTGTCTGGAAGTGTTAGGTTCATTTTATATTTGTGTCGGGAGAAATGTTCAGCTCTGGTGCAGACACTGGTGGCAGCCAGACCACGCTTGACTCCCTGGGTTGAAATTGAGAGAAAACTTATAGGATCMicrosatélite: HLM6 Número de acceso GenBank: U36498 Tamaño: 418 pbGATCCTGAGCACGGCACCTGGCACATTCATGGACATTCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATGCGTGCGCGCGCGCTGATATAGAGAGAAAGGGGAGGGAGGGAGCGGAAACAGAGACAAAGTGGAGAGATATCGAAAATGGGTCAAAATACTAATGGGTACACCTGGATAAAGGGTATATGGTTGTTTACCATCCAGGCAACTTTTCCACAAGTTTATCTTTAAATAAATGCATTTTAAAAATGGACCGTTGGCTGTTGTCCCAAATTTTGCCTAACCTTTGAGATTTCTGGCTTTGATTCCCGCAGCTGCCATCGCTAGCGTACCCAGACCCCAGAAGTGTGCAATGGTGACTTTAAAACAGTTGTCGCAGGTTCTGTCCCAGGCAAGAAAACCTGGATCMicrosatélite: HLM7 Número de acceso GenBank: no inscrita Tamaño: 104 pbGATCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGAGTGATATGTGGAAACCCTGGTCCTTGGGGATCArchivos de zootecnia vol. 48, núm. 178-179, p. 193.DETECCIÓN DE MICROSATÉLITES EN DNA EQUINOemisión lumínica capaz de impresio-nar una placa radiográfica en unosminutos.Las colonias positivas se siembranen medio de cultivo LB con 60 mg/mlde ampicilina, se incuban 12 horas a37°C y se extraen y purifican losplásmidos por lisis alcalina.Se utiliza un procedimiento de se-cuenciación automática basado en elmétodo de los didesoxinucleótidos deSanger et al. (1977) con los cuatrodidesoxinucleótidos terminadoresmarcados con fluorocromos distintos.Los productos de cada reacción seresuspenden en 4 ml de solución decarga (5:1, formamida desionizada yEDTA 50 mM, pH 8), se desnaturali-zan a 90°C durante 2 min, se enfríansobre hielo picado y se cargan en ungel de poliacrilamida que se ha colo-cado previamente en un secuenciadorautomático ABI 373 Strech (APPLIEDBIOSYSTEMS, PERKIN ELMER).La electroforesis se realiza a potenciaconstante (32 vatios) y 40 °C de tem-peratura. Se siguen las recomendacio-nes del fabricante para obtener la se-cuencia del fragmento de DNA en es-tudio.Se identifica la secuencia corres-pondiente al inserto del DNA y alplásmido y se resuelven las posiblesambigüedades comparando las secuen-cias complementarias obtenidas en lasdos reacciones.RESULTADOS Y DISCUSIÓNEn la tabla I se presenta el protoco-lo diseñado para la extracción de DNAgenómico a partir de sangre entera.La tabla II recoge las secuenciasde los fragmentos de DNA contenien-do los microsatélites detectados HLMIal 7.Clásicamente, para la obtención deDNA se ha utilizado la proteinasa K.Se propone un protocolo poco peligro-so, en lo referente a la utilización deproductos muy tóxicos, y económico.En el método descrito por Grobet et al.(1991) de extracción y purificación deDNA a partir de sangre, se consigueseparar el DNA de los complejosproteicos que le acompañan, mediantela acción de un agente caotrópico comola urea y un detergente como el SDSsin necesidad de emplear proteinasaK, lo que resulta más sencillo y barato.La última etapa de desproteinizaciónmediante fenol, cloroformo y alcoholisoamílico utilizada por estos autoresse sustituye por la técnica de deshidra-tación de Miller el al. (1988). Consisteen una precipitación salina de las pro-teínas incrementando la concentraciónfinal de NaCl en el medio hasta 1,5 M,lo que resulta incomparablemente másseguro y económico.El DNA obtenido con esta técnicatiene una proporción entre las absor-bancias a 260 nm y 280 mn que fluctúaentre 1,7 y 2, lo cual indica una buenadesproteinización. Por otra parte, hasido digerido con las enzimas de res-tricción HindIII, BamH1, EcoR1 ySau3A1, clonado en plásmidos,secuenciado y empleado como sustratopara la técnica de amplificación porPCR, obteniéndose en todos los casoslos resultados esperados.Para generar gran cantidad de frag-mentos pequeños, se digiere el DNAcon la enzima de restricción Sau3A1,cuya secuencia de reconocimiento esde sólo cuatro bases (GATC), por loArchivos de zootecnia vol. 48, núm. 178-179, p. 194.VEGA-PLA ET AL.tanto, desde un punto de vista proba-bilístico, debe ser muy abundante en elgenoma. Las tallas seleccionadas va-rían entre 200 y 400 pb aproximada-mente. Se escoge el límite de 400 pbpara garantizar la obtención de la se-cuencia del fragmento con una solareacción de secuenciación.Se elige una sonda (TG)7T, quepermite detectar tanto microsatélitesque contienen secuencias con muchasrepeticiones CA, así HLM2 con 21repeticiones, HLM6 con 18 y HLM7con 19, como las secuencias con mi-crosatélites imperfectos, así HLM3,con una secuencia de 8 pb entre dosgrupos de 11 y 4 repeticiones, y HLM5,con 8 pb entre dos grupos de 9 y 7repeticiones.El problema que surge al utilizaruna sonda tan corta es que tambiénpuede detectar microsatélites de pocasrepeticiones, como HLM1, HLM4 yHLM5.BIBLIOGRAFÍAEllegren H., M. Johansson, K. Sandberg and L.Andersson. 1992. Cloning of highly poly-morphic microsatellite in the horse. AnimalGenetics, 23: 133-142.Grobet L., A. Schwers, J. Roupain et R. Janset.1991. Les empreintes génétiques et autresmarqueurs dans les controles de fillationchez les animaux domestiques. Annales deMédecine Vétérinaire, 135: 245-253.Guérin, G. and M. Bertaud. 1996. Characterizationof two new horse microsatellites: HMS15 andHMS20. Animal Genetics, 27: 123.Marklund S., H. Ellegren, S. Eriksson, K. Sandbergand L. Andersson. 1994. Parentage testingand linkage analysis in the horse using a setof highly polymorphic microsatellites. AnimalGenetics, 25: 19-23.Miller, S.A., D.D. Dykes and H.F. Polesky.1988. A simple salting out procedeure forextracting DNA from human nucleated cells.Nucleic Acids Research, 16: 1216.Moazami-Goudarzi, K., D. Vaiman, D. Mercier,C. Grobs, J.P. Furet, H. Levéziel et P. Martin.1994. Emploi de microsatellites pour l’analysede la diversité génétique des races bovinesfrançaises: premiers résultats. GénétiqueSélection Evolution, 26: 155-165.Stallings, R.L., A.F. Ford, D. Nelson, D.C. Tomey,C.E. Hildebrand and R.K. Moyzis. 1991.Evolution and distribution of GTn repetitivesequences in human genomes. Genomics,10: 807-815.Tautz D. 1989. Hypervaryability of simplesequences as a general source for poly-morphic DNA markers. Nucleic AcidsResearch, 17: 6463-6471.Vega Pla, J.L. 1996. Polimorfismo de ADN equi-no. Obtención de marcadores moleculares ysu aplicación al control de paternidad. Tesisdoctoral. Universidad de Córdoba.

Methodology proposal for the location of microsatellites in the equine genome

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