Study of the Ribosomal Stress Pathway in Pluripotency, Cancer and Disease

Abstract

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología MolecularLa vía de estrés ribosomal se describió hace más de una década como una nueva vía activadora de p53. Dicha vía monitoriza la homeostasis de la biogénesis ribosomal. Perturbaciones en cualquiera de las etapas de la biosíntesis del ribosoma, transcripción del DNA ribosomal, procesamiento del RNA ribosomal, ensamblaje o transporte nuclear, conllevan un exceso de proteínas ribosomales no unidas al ribosoma. En este contexto, el complejo pre-ribosomal RPL11/RPL5/5S rRNA inhibe MDM2, activando así al supresor tumoral p53. La activación de p53 puede resultar en diferentes respuestas celulares que impiden que las células dañadas se conviertan en tumorales. Una de las preguntas que hemos abordado en este trabajo es si las células madre pluripotentes de ratón, caracterizadas por altas tasas de división celular, presentan mecanismos que monitoricen la homeostasis de la biogénesis ribosomal para salvaguardar la integridad de la progenie. Aquí demostramos que dichas células tienen funcional la vía de estrés ribosomal y que esta vía activa p53 en respuesta al estrés ribosomal y elimina aquellas células dañadas mediante un proceso de apoptosis. Las células tumorales requieren a una mayor producción de ribosomas para mantener las altas tasas de división celular que las caracterizan. En este trabajo hemos llevado a cabo un rastreo de compuestos que tengan como diana el nucléolo, la fábrica de ribosomas de la célula, con la finalidad de perturbar la producción de ribosomas y eliminar así las células cancerígenas. Hemos testado dos colecciones de compuestos químicos y hemos identificado un grupo de derivados de acridina que inhiben la transcripción del ADN ribosomal y, por tanto, generan la pérdida de la integridad del nucleolo. Esto resulta en la activación de p53 en ausencia de daño a través de la vía de estrés ribosomal. Finalmente, estos compuestos ralentizan el crecimiento celular y activan un proceso de apoptosis en distintas líneas de células tumorales. RPL11, proteína clave en la vía de estrés ribosomal, se encuentra mutada en heterozigosis en pacientes de anemia de Diamond-Blackfan. Hemos generado un alelo nulo condicional para Rpl11 y hemos demostrado que la pérdida de un alelo de Rpl11 en ratones adultos recapitula las principales características de la enfermedad, incluyendo un procesamiento inadecuado del ARN ribosomal, anemia macrocítica debida a una maduración eritroide defectuosa y una mayor predisposición a cáncer. Los ratones haploinsuficientes para Rpl11 muestran una linfomagénesis acelerada, lo que puede deberse a dos mecanismos no excluyentes: una vía de estrés ribosomal defectuosa y mayores niveles basales de la proto-oncoproteína c-MYC. En resumen, nuestro trabajo pone de manifiesto la importancia de la vía de estrés ribosomal y, en particular de RPL11, en la fisiología, incluyendo células madre embrionarias y el organismo adulto, así como para el desarrollo del cancer y su terapia.The ribosomal stress (RbS) pathway was described more than a decade ago as a new p53- activating pathway. This pathway monitors the homeostasis of the ribosome biogenesis. Perturbations in any of the steps comprising ribosome biosynthesis, rDNA transcription, rRNA processing and ribosome assembly and export, lead to the accumulation of ribosome-free ribosomal proteins. In this situation, RPL11/RPL5/5S rRNA pre-ribosomal complexes bind and inhibit MDM2, thus activating p53. Activation of p53 can result in different cellular outcomes that prevent damaged cells from becoming malignant. We wanted to explore whether mouse pluripotent stem cells, characterized by a rapid growth rate, present mechanisms to monitor the homeostasis of ribosome biogenesis as a way to ensure an optimal quality of their progeny. We have demonstrated that mouse pluripotent stem cells rely on an operative ribosomal stress pathway to eliminate damaged cells upon RbS. Importantly, p53 plays a key role in this process by eliciting apoptsis in embryonic stem cells following RbS. Cancer cells require high rates of ribosome biogenesis to sustain their rapid growth. To target this Achilles’ heel of cancer cells we have designed a cellular screen that monitors the integrity of the nucleolus, the ribosome factory, to identify small molecule compounds that disrupt ribosome biogenesis. By performing chemical library screens, we have identified a group of acridine derivatives that inhibits rDNA transcription, and thus cause nucleolar disruption. This results in p53 activation through the RbS pathway, and in the absence of detectable DNA damage. Remarkably, these compounds hamper proliferation and trigger apoptosis of different cancer cell lines, providing new therapeutical opportunities against cancer. Heterozygous mutations of RPL11, a key player in the RbS pathway, have been found in Diamond-Blackfan Anaemia (DBA) patients. To that end, we generated a conditional knockout mouse model for Rpl11. Here we demonstrate that partial loss of Rpl11 recapitulates the main pathologies of DBA, including impaired rRNA processing, macrocytic anaemia and cancer predisposition. Rpl11 haploinsufficient mice have reduced number of erythroid progenitors and delayed erythroid differentiation. These animals show accelerated lymphomagenesis, probably due to two non-exclusive mechanisms: defective activation of p53 through the RbS pathway and increased basal levels of c- MYC. In summary, our work provide insights into the biological relevance of the RbS pathway and, in particular of RPL11, in the physiology, including mouse pluripotent stem cells and the adult organism, as well as in cancer development and possible treatment