Metabolismo del peptidoglicano de Salmonella en el interior de células ecuariotas

Abstract

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 15-10-2015El peptidoglicano es un componente esencial de la pared celular que rodea por completo a la bacteria y de cuya integridad depende la viabilidad celular. Esta estructura es un heteropolímero formado por largas cadenas glucídicas entrecruzadas por cadenas peptídicas cortas. El peptidoglicano experimenta continuos procesos de remodelado que facilitan la adaptación de la bacteria a condiciones ambientales cambiantes. En estrecha correlación con los diversos enlaces existentes en el peptidoglicano, hoy se conocen una gran cantidad de enzimas implicadas en su metabolismo, a las que hemos dividido, en este trabajo, en cuatro grupos según su actividad: biosíntesis (BIO), modificación (MOD), hidrólisis (HID) y reciclaje (REC). Salmonella enterica es un patógeno intracelular que causa infecciones en un amplio rango de hospedadores. En esta Tesis hemos empleado fibroblastos como modelo de línea celular. En este tipo celular S. enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) establece un estado de baja proliferación, similar al observado in vivo en bacteria que coloniza tejidos animales. Hemos identificado un total de cuarenta y ocho genes de S. Typhimurium cuyos productos podrían tener una actividad enzimática definida sobre el metabolismo del peptidoglicano. Dentro de estos genes, cinco de ellos, STM1836, STM1910, STM1940, STM3277 y STM4217, se incluyeron en el estudio por estar presentes de forma diferencial en el género Salmonella. STM1836 y STM1910 muestran una identidad del 65 % con los genes mrdA y ftsI, los cuales codifican las proteínas PBP 2 y PBP.3, esenciales en la biosíntesis del peptidoglicano. Por otro lado, STM1940 codifica una enzima con actividad DL-endopeptidasa. La producción de STM1940 aumenta en bacteria intracelular obtenida de células eucariotas, es regulada por el sistema de dos componentes PhoPPhoQ y es necesaria para la virulencia en un modelo de ratón. Durante la infección de fibroblastos se han observado cambios en la maquinaria enzimática del peptidoglicano. Dentro de la célula infectada, S. Typhimurium aumenta la producción de YbiS e YnhG dentro del grupo de enzimas de biosíntesis; PBP 5, PBP 6, PBP 6B, PBP 7, Spr, NlpC y STM1940 como enzimas de modificación; MltA y EmtA dentro de las enzimas de hidrólisis; y NagZ, LdcA y Mpl como enzimas de reciclaje. La existencia de enzimas que reconocen un mismo enlace en el peptidoglicano ha dificultado la obtención de fenotipos en el modelo de infección de fibroblastos. Se ha analizado además la estructura del peptidoglicano de S. Typhimurium obtenido de bacteria intracelular en estado no proliferativo. Este estudio concluyó con la identificación de un componente del peptidoglicano no descrito con anterioridad correspondiente a un muropéptido no entrecruzado que contiene, en la cuarta posición de la cadena peptídica lateral, una molécula de aminoalcohol (alaninol o 1-amino-2-propanol). Esta Tesis describe, de forma completa, el conjunto de enzimas implicadas en el metabolismo del peptidoglicano de S. Typhimurium, centrándose en su regulación en el ambiente extracelular e intracelular además de su contribución a la infección. Información adicional aportada en este trabajo incluye la definición de la estructura del peptidoglicano en bacteria intracelular obtenida de fibroblastos, además del estudio y actividad de la enzima STM1940, codificada en una isla genómica exclusiva del género SalmonellaPeptidoglycan is an essential component of the cell wall that surrounds the bacteria completely and whose integrity ensures bacterial viability against internal osmotic pressure. This structure is a heteropolymer formed by long glycan chains cross-linked by short stem peptide chains. The peptidoglycan is continuously remodeled what facilitates bacterial adaptation to changing environmental conditions. In close relationship to the diversity of bonds known to be present in the peptidoglycan, a large number of enzymes are also involved in its metabolism, which we divided in four groups in this work: biosynthesis (BIO), modification (MOD), hydrolysis (HID) and recycling (REC). Salmonella enterica is an intracellular pathogen that causes infections in a broad range of hosts. In this Thesis, we used fibroblasts as cell line model, since S. enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) adapts in this cell type to a non-proliferative stage, similar to that observed when bacteria colonize host tissues in vivo. We have identified forty eight genes of S. Typhimurium whose products are predicted to have a well-defined enzymatic activity on the peptidoglycan metabolism. Five of these genes, STM1836, STM1910, STM1940, STM3277 and STM4217, were included in this investigation because they are present almost exclusively in the Salmonella genus. STM1836 and STM1910 exhibit 65 % identity at the amino acid level with the products of mrdA and ftsI, genes that encode PBP 2 and PBP 3, essential biosynthetic proteins involved in the elongation and division phases, respectively. On the other hand, STM1940 encodes an enzyme with DL-endopeptidase activity. The production of STM1940 increase in intracellular bacteria obtained from eukaryotic cells, it is regulated by the two component system PhoP-PhoQ and it is necessary for virulence in the mouse model. During fibroblast infection we have observed changes in the enzymatic machinery of the peptidoglycan. Inside the infected cell, S. Typhimurium increases the production of: the biosynthetic enzymes YbiS and YnhG; the modification enzymes PBP 5, PBP 6, PBP 6B, PBP 7, Spr, NlpC and STM1940; MltA and EmtA as hydrolytic enzymes; and, NagZ, LdcA and Mpl as recycling enzymes. The redundancy of enzymes acting over the same bond of the peptidoglycan has complicated the identification of phenotypes in the fibroblast infection model. We have also analyzed the structure of the peptidoglycan of S. Typhimurium obtained from intracellular bacteria in a non-proliferative state. This study led to the identification of a new component of its peptidoglycan that corresponds to a non-cross-linked muropeptide that contains an aminoalcohol molecule (alaninol or 1-amino-2-propanol) in the fourth position of the peptide chain. Therefore, this Thesis describes in a comprehensive manner, the enzymatic machinery involved in the peptidoglycan metabolism of S. Typhimurium. This study was focused on aspects related to peptidoglycan regulation in bacteria adapting to extracellular and intracellular environments as well as its contribution to the infection. This work also includes the definition of the peptidoglycan structure of non-growing bacteria inside fibroblasts and, in addition, the characterization of a novel DL-endopeptidase, STM1940, encoded in a genomic island exclusive of the Salmonella genu