Analysis of haploinsufficiency in women carrying germline mutations in the BRCA1 gene: Different mutations, different phenotypes ?

Abstract

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Medicina, Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 30-01-2015BRCA1 germline mutations are associated with significantly increased lifetime risk of developing breast and ovarian cancers. However, taking into account considerable differences in disease manifestation among mutation carriers, it is probable that various BRCA1 mutations lead to formation of distinct phenotypes and haploinsufficiency effects and that both type and location of the mutation could play an important role in cancer initiation. PARP inhibitors are currently one of the most promising agents for treatment of tumors deficient in BRCA1 or BRCA2. However, cancer patients carrying germline mutation in BRCA1/2 genes show a big variability in the responses to PARP inhibitors in clinical trials. Thus, we were interested in investigating whether and how BRCA1 mutation type influences the response of cells to PARP inhibitors We used a panel of lymphoblastoid cell lines (LCLs) derived either from heterozygous BRCA1 mutation carriers or non-carriers in order to study haploinsufficiency effects of various mutation types (truncating vs missense). LCLs carrying truncating mutations showed significantly lower BRCA1 mRNA and protein levels and higher levels of gamma-H2AX than control cells or LCLs harboring missense mutation, indicating increased spontaneous DNA damage in these cells. However, cells carrying either of the BRCA1 mutation type showed impaired RAD51 foci formation, suggesting defective repair in mutated cells and a possible mechanism of increased susceptibility of mutation carriers to cancer. Moreover, gene expression analysis revealed that LCLs carrying missense mutations showed more distinct expression profile than cells with truncating mutations when compared to controls, suggesting that different mutations may lead to distinct phenotypes and haploinsufficiency effects. Importantly, decreased expression of immune response-related genes in cells harboring missense mutation indicates possible mechanisms of breast cancer initiation in carriers of these particular BRCA1 mutations. At the present study, we are describing for the first time that cells derived from carries of missense mutations in the BRCA1 BRCT domain show higher sensitivity to PARP inhibitor olaparib than cells with truncating mutations or WTs. These results indicate that carriers of different mutation types could benefit from the treatment in a distinct way and that they could display different toxicity to the agent. Taking into account the presence of non-degraded mutated protein in cells carrying missense mutation there is a possibility that the missense mutants act in a dominant negative manner on the WT protein function. Thus, we hypothesize that there is a competition between mutated and WT BRCA1 protein in the recruitment to DNA damage sites, which could lead to an alteration the DNA repair process and decreased viability of cells carrying BRCA1 missense mutation. The mechanism of increased sensitivity of cells carrying missense mutation to olaparib could be, at least partially, also related to possible changes in olaparib-specific BRCA1 protein interactors in mutated cells. In addition, regulation of miR-222-3p and its target FOS by olaparib treatment in cells carrying missense mutation suggest a possible use of these molecules as markers of sensitivity to the treatment. In summary, our results bring new insights on how various heterozygous mutations in BRCA1 could lead to impairment of BRCA1 function and show a strong evidence about haploinsufficiency in BRCA1 mutation carriers. Moreover, our results indicate that carriers of different types of BRCA1 mutations could benefit from the treatment in a distinct way and that could show different toxicity to the PARP inhibitor olaparib.Mutaciones germinales en BRCA1 están asociadas con un incremento significativo en el riesgo a desarrollar cáncer de mama y ovario. Sin embargo, teniendo en cuenta las considerables diferencias en la manifestación de la enfermedad en portadoras de mutación, es probable que distintas mutaciones en BRCA1 den lugar a distintos fenotipos y efectos de haploinsuficiencia, y que tanto el tipo de mutación como su localización puedan jugar un papel importante en la iniciación del cáncer. Los inhibidores de PARP son actualmente uno de los agentes más prometedores para el tratamiento de tumores deficientes en BRCA1 o BRCA2. No obstante, enfermas de cáncer portadoras de una mutación germinal en los genes BRCA1/2 muestran una gran variabilidad en la respuesta a inhibidores de PARP en ensayos clínicos. Por estos motivos, nuestro interés ha radicado en investigar si el tipo de mutación en BRCA1 influye en la respuesta de las células a inhibidores de PARP y en caso afirmativo, averiguar cuál es el mecanismo responsable. Utilizamos un panel de células linfoblastoides (LCLs) derivadas bien de portadoras heterocigotas de mutación en BRCA1 o bien de no portadoras de mutación con el objetivo de estudiar los efectos de haploinsuficiencia que tienen distintos tipos de mutaciones (de proteína truncada vs de cambio de aminoácido). Las LCLs portadoras de mutaciones de proteína truncada mostraron niveles significativamente menores de ARNm y proteína BRCA1 y niveles superiores de gamma-H2AX que las células control o que las LCLs portadoras de mutación de cambio de aminoácido, lo que indica un incremento espontáneo en el daño del ADN en estas células. Sin embargo, las células portadoras tanto de un tipo como de otro de mutación, mostraron una disminución en la formación de focos de RAD51, lo que sugiere una reparación defectuosa en las células mutadas y un posible mecanismo de aumento de susceptibilidad al cáncer en portadoras de mutación. Además, los análisis de expresión génica revelaron que las LCLs portadoras de mutaciones de cambio de aminoácido mostraban perfiles de expresión más diferentes que las células con mutaciones de proteína truncada al compararlas con los controles, lo que sugiere que mutaciones diferentes podrían dar lugar a distintos fenotipos y efectos de haploinsuficiencia. De manera importante, la disminución en la expresión de genes asociados a la respuesta inmune observada en las células portadoras de mutaciones de cambio de aminoácido, indica un posible mecanismo de iniciación del cáncer de mama en portadoras de estas mutaciones concretas en BRCA1. En el presente estudio, describimos por primera vez que las células derivadas de portadoras de mutaciones de cambio de aminoácido en el dominio BRCT de BRCA1 muestran mayor sensibilidad al inhibidor de PARP olaparib que las células con mutaciones de proteína truncada o WT. Estos resultados indican que portadoras de distintos tipos de mutación podrían beneficiarse del tratamiento de distinta manera y que podrían mostrar diferente toxicidad al agente. Teniendo en cuenta la presencia de proteína mutada no degradada en las células portadoras de mutación de cambio de aminoácido, cabría la posibilidad de que los mutantes de cambio de aminoácido tengan un efecto dominante-negativo sobre la función de la proteína WT. De esta manera, planteamos la hipótesis de que existe una competición entre la proteína mutada y la WT en el reclutamiento a los sitios de daño en el ADN, lo que podría dar lugar a una alteración en el proceso de reparación del ADN y una disminución en la viabilidad de las células portadoras de mutaciones de cambio de aminoácido en BRCA1. El mecanismo de incremento en la sensibilidad a olaparib de las células portadoras de mutaciones de cambio de aminoácido podría estar asociado, al menos en parte, a posibles cambios en las proteínas específicas para olaparib que interaccionan con BRCA1 en las células mutadas. Además, la regulación del miR-222-3p y su diana FOS por el tratamiento de olaparib en células portadoras de mutaciones de cambio de aminoácido sugiere un posible uso de estas moléculas como marcadores de sensibilidad al tratamiento. En resumen, nuestros resultados aportan nuevos conocimientos sobre cómo distintas mutaciones heterocigotas en BRCA1 podrían dar lugar a defectos en la función de BRCA1 y muestran gran evidencia de haploinsuficiencia en portadoras de mutaciones en BRCA1. Además, nuestros resultados indican que portadoras de distintos tipos de mutaciones en BRCA1 podrían beneficiarse del tratamiento de distinta forma y podrían mostrar toxicidades diferentes al inhibidor de PARP olapari