Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología. Fecha de lectura: 30-06-2014Eukaryotic
genomes
are
divided
into
expression
domains,
which
contain
DNA
coding
sequences
together
with
all
the
regulatory
elements
needed
for
their
correct
spatio-‐
temporal
expression
pattern.
Genomic
boundaries,
also
known
as
insulators,
flank
these
domains
preventing
undesirable
crosstalk
between
the
regulatory
elements
of
neighboring
domains.
They
employ
various
mechanisms
and
thus,
are
functionally
rather
than
structurally
defined.
For
this
reason,
in
an
attempt
to
find
boundaries
in
a
genome-‐
wide
unbiased
fashion
in
mammals,
we
focused
on
identifying
those
loci
where
the
presence
of
boundary
function
would
be
required
to
satisfy
a
biological
need.
For
example,
we
hypothesized
that
adjacent
genes
with
opposite
expression
patterns
would
need
to
be
separated
by
boundaries
to
maintain
the
independency
of
their
different
expression
domains.
Also,
boundaries
could
be
found
partitioning
the
chromatin
into
inactive
heterochromatic
and
active
euchromatic
domains,
impeding
the
deleterious
effects
the
spread
of
the
former
would
have
on
the
latter.
Finally,
boundaries
could
also
bracket
clusters
of
co-‐expressed
genes
to
ensure
their
co-‐regulation
and
co-‐expression.
Different
algorithms,
based
on
the
analysis
of
gene
expression
data,
were
developed
in
order
to
explore
these
scenarios.
The
resulting
evolutionarily
conserved
non-‐coding
putative
insulator
sequences
were
functionally
validated
using
a
number
of
assays.
Their
enhancer-‐
blocking
properties
were
evaluated
in
vitro
in
human
cells
in
culture,
and
then
in
vivo
by
using
transgenic
zebrafish.
Additionally,
one
of
the
most
powerful
elements
was
further
tested
for
its
ability
to
protect
from
chromosomal
position
effects
in
transgenic
mice.
The
description
and
characterization
of
new
genomic
boundaries
would
shed
some
light
into
the
way
mammalian
genomes
are
organized,
as
well
as
expand
the
repertoire
of
genetic
tools
that
can
be
incorporated
in
heterologous
constructs
to
improve
the
gene
transfer
technologies
by
preventing
chromosomal
position
effects.Los
genomas
de
eucariotas
están
divididos
en
dominios
de
expresión,
que
se
definen
como
aquellas
porciones
del
genoma
que
contienen
uno
o
varios
genes
y
todos
los
elementos
reguladores
necesarios
para
que
que
se
expresen
de
acuerdo
con
un
patrón
espacio-‐temporal
concreto.
Los
aisladores
genómicos,
también
llamados
insulators,
flanquean
estos
dominios
y
los
protegen
de
la
influencia
no
deseada
de
los
elementos
reguladores
contenidos
en
los
dominios
vecinos.
Existen
diversos
mechanismos
de
aislamiento,
por
lo
que
los
insulators
no
se
definen
por
una
secuencia
de
ADN
concreta,
sino
porque
comparten
una
misma
función.
Así,
para
encontrar
aisladores
en
el
genoma
de
mamíferos
de
una
forma
no
sesgada,
nos
propusimos
identificar
aquellas
posiciones
del
genoma
donde
se
requiere
la
presencia
de
función
aisladora
para
satisfacer
un
problema
biológico.
Por
ejemplo,
genes
adyacentes
con
perfiles
de
expresión
completamente
distintos
deberían
estar
separados
por
aisladores
que
mantuviesen
dominios
de
expresión
independientes.
Asimismo,
cabe
esperar
la
presencia
de
aisladores
entre
dominios
silentes
de
heterocromatina
y
dominios
activos
de
eucromatina.
Aquí,
impedirían
los
efectos
perjudiciales
que
el
avance
de
los
primeros
tendrían
sobre
los
segundos.
Finalmente,
también
podrían
encontrarse
aisladores
flanqueando
grupos
de
genes
co-‐expresados
para
asegurar
su
co-‐regulación
y,
por
tanto,
co-‐expresión.
Basándonos
en
estos
escenarios,
se
desarrollaron
diversos
algoritmos
que
usaban
datos
de
expresión
génica
para
predecir
la
presencia
de
aisladores.
Como
resultado
de
estos
algoritmos,
se
obtuvo
una
serie
de
secuencias
conservadas
evolutivamente
y
no
codificantes
que
se
validaron
funcionalmente
empleando
varios
tests.
La
capacidad
de
bloqueo
de
enhancers
se
evaluó
mediante
ensayos
in
vitro
en
células
humanas
en
cultivo
primero,
y
luego
in
vivo
mediante
el
uso
de
peces
cebra
transgénicos.
Además,
se
analizó
la
capacidad
de
uno
de
los
elementos
más
potentes
para
proteger
de
efectos
de
posición
cromosomales
en
ratones
transgénicos.
La
descripción
y
caracterización
de
nuevos
aisladores
genómicos
no
sólo
sirve
para
entender
mejor
cómo
se
organizan
los
genomas
de
mamíferos.
También
es
útil
para
ampliar
el
abanico
de
herramientas
disponibles
que
se
pueden
usar
en
construcciones
heterólogas
para
bloquear
los
efectos
de
posición
cromosomales
que
se
dan
comúnmente
en
experimentos
de
transferencia
genética