Okamoto, Kentaro

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Okayama University Scientific Achievement Repository

   指 導 教 授 氏 名 指 導 役 割             印  研究の総括的指導             印  実験，研究方針，論文作成指導             印    学 位 論 文 要 旨 岡山大学大学院医歯薬学総合研究科   専攻分野  歯周病態学分野  身分  大学院生  氏名    岡本  憲太郎  論文題名 コラーゲン結合型塩基性線維芽細胞増殖因子は その高い組織内滞留性によって効率的に歯周組織再生を促進する  【緒言】 塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor：bFGF）の臨床応用が開始された。しかし，bFGF製剤は局所組織中における滞留性の低さから，適応が垂直性骨欠損に限定され，水平性骨欠損への適応は困難である。 そこで，増殖因子に滞留性を持たせる薬物送達システムに着目した。C. histolyticumが産生するコラゲナーゼのC末端側には，コラーゲン結合ドメイン（Collagen binding domain：CBD）が存在する。このCBDとbFGFから成る融合タンパク質（Collagen binding-bFGF：CB-bFGF）を精製した。精製したCB-bFGFを基材としてのコラーゲンパウダー（CP）と混和し，ラットの水平性骨欠損モデルへ投与したところ，術後8週において，bFGFと比較して有意に歯槽骨形成を促進した。 本研究では，CB-bFGFの歯周組織再生療法への応用を目指し、bFGFの有効性が示されている中型動物を用いて，CB-bFGFの有効性を評価した。また，CB-bFGFの動態と生物学的活性を検討した。 【材料と方法】 1. 試料：CB-bFGF は，大腸菌発現系を用いて生産し，アフィニティ・クロマトグラフィーにて精製した。精製したタンパク質は，ロットごとにコラーゲン結合活性と細胞増殖活性を確認した。併用するコラーゲン基剤は，CP を用いた。 2. 使用動物：イヌの 2壁性骨欠損モデルを用いて，CB-bFGF/CP の有効性を検討した。ラットの水平性骨欠損モデルを用いて，CB-bFGF の組織内滞留性と生物学的活性を検討した。 3. イヌの 2 壁性骨欠損の作製：第二前臼歯遠心と第一後臼歯近心に 2 壁性骨欠損を作製し，CB-bFGF/CP（比 1.45 nmol/12.5 mg）を填入した。対照群として，bFGF/CP とリン酸緩衝生理食塩水（PBS）/CP を用いた。術後 4週において，下顎骨を摘出した。 4. ラット水平性骨欠損の作製：Nakamura らの方法（J. periodontol. 2019）に従って水平性骨欠損を作製した。各実験で設定した時間経過後，上顎骨を摘出した。 5. 組織切片の作製：前述の方法で得たイヌの下顎骨または，ラットの上顎骨を固定および脱灰後，パラフィン包埋した。ブロックを連続的に厚さ 4 µmで薄切し，組織切片を得た。 6. 新生骨体積の定量：イヌの下顎骨を単純 CT で撮像し，三次元構築して新生骨量を定量した。  7. イヌ歯周組織の組織学的形態計測：イヌ歯周組織の組織切片を Azan染色後に，新生骨面積と新生セメント質の長さを計測した。 8. CB-bFGF のコラーゲンパウダーからの徐放量と滞留量の定量：CB-bFGF/CP または bFGF/CP（比 0.1 nmol/5 mg）を 1 mL の PBS 中に浸漬し，経時的に上清を回収した。上清中のCB-bFGF/CP または bFGF/CP 量を ELISA 法で定量した。実験開始から 168 時間後に，CP 中に残存している CB-bFGF または bFGF を Western blotting で検出した。  9. ラット歯周組織の免疫組織化学染色：ラット歯周組織の組織切片を抗ヒト bFGF 抗体，抗ラット Ki67抗体，そして抗ラット PDGFR抗体を用いて免疫組織化学染色を行った。 10. フローサイトメトリー法による MSC 数と FGFR1 陽性細胞の定量：第一大臼歯口蓋側歯肉を摘出し，得られた細胞中の間葉系幹細胞（MSC）細胞数と FGFR1 陽性細胞数をフローサイトメトリー法で定量した。 11. 統計解析：2 群間以上の差の検定には，one-way analysis of variance（one-way ANOVA）を用いた。多重比較検定には，Tukey/Kramer testを用いた。2 群間の差の検定には，Student’s t-test を用いた。p値が 0.05 未満の場合を有意差ありと判定した。 【結果】 1. イヌ歯周組織おけるCB-bFGF/CPの有効性の確認：CB-bFGF/CP群では，術後 4週にで，PBS/CP群と比較して有意に新生歯槽骨量が増加した。また，組織学的形態計測の結果から，CB-bFGF/CP群では，術後 4週で，PBS/CP群と bFGF/CP群の両群と比較して有意に新生歯槽骨面積が増加した。一方で，新生セメント質の形成は，全ての群において確認され，増加傾向にあったが有意な差ではなかった。  2. CB-bFGFのコラーゲンパウダーからの徐放性と滞留性（ in vitro）：bFGFと比較してCB-bFGFの方がより緩徐に徐放された。さらに，168時間後のCP中に，CB-bFGFは明瞭に検出されたが， bFGFはかすかに検出したのみであった。 3. CB-bFGFの滞留性（ in vivo）：bFGFとCB-bFGFはいずれも組織中で確認された。bFGFは術後 3日目から顕著に減少した，CB-bFGFは術後 5日目でも明瞭に確認された。 4. ラット歯周組織における細胞増殖への影響：Ki67陽性細胞は，bFGF群では，術後 3日目から 5日目で大きな変化が無かったが，CB-bFGF群では，術後 5日目で顕著に増加した。PDGFRα陽性細胞は，両群で，術後3日目と比較して術後 5日目で増加し，CB-bFGF群においてその傾向は顕著であった。 5. ラット歯周組織における間葉系幹細胞と FGFR1陽性細胞への影響：FGFR1の陽性細胞数に差はなかったが，MSC数およびFGFR1陽性MSC数は，CB-bFGF群の方が増加する傾向があった。 【考察】 イヌの垂直性骨欠損モデルにおいて，CB-bFGF/CPは bFGF/CPと比較して，歯槽骨再生を促進し，セメント質や歯根膜新生が確認された。この結果からCB-bFGF/CPがより効率的に歯周組織再生を導く可能性が示された。  In vitroでの徐放性および滞留性試験において，CB-bFGFはコラーゲン基剤からより緩徐に放出され，基剤中に長期に滞留した。また，in vivoにおいて，CB-bFGFは，bFGFと比較して，局所組織中に長期に滞留した。さらに，免疫組織化学染色の結果から，CB-bFGFは，より長期に細胞増殖活性を刺激し，結合組織のリモデリングを促進する可能性が示された。最後に，フローサイトメトリー解析の結果から，CB-bFGFを投与すると，bFGF投与時と比較して， FGFR1を発現している細胞数には差がないが，MSC数は増加し，FGFR1陽性のMSC数も増加する傾向があった。このことから，CB-bFGFが通常発現しているFGFR1に持続的に作用することでMSCの増殖を促進する可能性が示された。  以上のことから，CB-bFGFは，局所組織および基剤中に滞留し徐放されることによって，創傷治癒初期の細胞増殖や局所組織中の再生環境を整えるといったbFGFが本来持っている機能を，より長期に発揮することで歯周組織再生における有効性を増強すると考えられる。CB-bFGFは，その徐放性と滞留性から，より困難な条件の再生療法への応用が期待できる。今後は，中型動物における水平性骨欠損モデルにおいて有効性を検討する必要がある 【結論】 CB-bFGFとコラーゲン基剤から成る複合剤の中型動物の歯周組織再生療法における有効性は，bFGFと比較して同等以上であった。また，CB-bFGFはbFGFと比較して歯周組織中に基剤とともに長期に滞留し，bFGFの効果を長期に持続することで，より歯周組織再生を亢進すると考えられる。                                    様式甲－３  

コラーゲン結合型塩基性線維芽細胞増殖因子はその高い組織内滞留性によって効率的に歯周組織再生を促進する

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