Ito, Yohei

Katsumata, Emiko

Nishino, Naoki

Sonoyama, Kei

Teresia Aluoch Muhomah,

Tsuruta, Takeshi

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Intracellular uptake of extracellular vesicles shed by bone marrow-derived macrophages stimulated with lactic acid bacteria in adipocyte and skeletal muscle cell line

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乳酸菌を貪食したマクロファージが放出する細胞外小胞の脂肪細胞および骨格筋細胞への取り込み Intracellular uptake of extracellular vesicles shed by bone marrow-derived macrophages stimulated with lactic acid bacteria in adipocyte and skeletal muscle cell line 鶴田 剛司 1、伊藤 洋平 1、西野 直樹 1、Teresia Aluoch Muhomah1、 勝又恵実子 1、園山 慶 2  Takeshi Tsuruta1, Yohei Ito1, Naoki Nishino1, Teresia Aluoch Muhomah1,   Emiko Katsumata1, Kei Sonoyama2 1 岡山大学大学院環境生命科学研究科2北海道大学大学院農学研究院 1Okayama University Graduate School of Environmental and Life Science 2Hokkaido University, Research Faculty of Agriculture はじめに 細胞外小胞(Extracellular vesicles :EVs)は直径30～100nm の膜小胞であり、マクロファージ、白血球、上皮細胞、腫瘍細胞などの多様な細胞から分泌される（1）。分泌された EVs 内には分泌細胞由来のタンパク質、Messenger RNA（mRNA）、microRNA（miRNA）が含まれており、これらの分子を介して細胞間・組織間の情報伝達を行う（2）。我々は生体内で起こる様々な細胞間情報伝達の中でも、マクロファージ-脂肪細胞間および-骨格筋細胞間の EVs を介した細胞間情報伝達に着目し、研究を進めてきた。マクロファージは腸管をはじめとする様々な組織に存在する免疫細胞で、マクロファージが分泌する EVs は脂肪細胞に取り込まれることが報告されている（3）。また、マクロファージはプロバイオティック乳酸菌の刺激により活性化し、マクロファージの分泌物のプロファイルが変化することが報告されている（4）。しかし、プロバイオティック乳酸菌の刺激がマクロファージの分泌する EVsの分泌量、EVs内のタンパク質発現量、脂肪細胞および骨格筋細胞への EVs の取り込み量にどのような影響を及ぼすかはこれまで検証されていない。そこで本研究では、マウス骨髄由来のマクロファージをプロバイオティック乳酸菌Lactobacillus plantarum No14 株（LP14）で刺激し、分泌された EVs を用いてそれらを検証した。 方法 マウス骨髄由来マクロファージの培養7 週齢の雄性 C57BL/6 マウスから大腿骨および腓骨を採取した。骨の両端を切り、片側の骨の切断面より注射針を挿入し、RPMI 培地を充填したシリンジを用いて骨髄細胞を回収した。回収した骨髄細胞をセルストレイナー（70 μm）に通した後に、3 mL の ACK lysis buffer を添加し、室温で5 分間静置した。RPMI 培地で骨髄細胞を洗浄後、15 cm デ ィ ッシ ュ に 播 種 し 、 分 化 誘 導 培 地（DMEM、20%L929 培養上清、10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン/ゲンタマイシン）で培養した。3 日ごとに培地を交換し、80％コンフルエントに達するまで培養した後に、骨髄由来のマクロファージとして供試した。細胞外小胞の回収培地を試験培地（DMEM、1%L929 培養上清、1%EVs フリーFBS、ペニシリン/ストレプトマイシン/ゲンタマイシン）に置換した。対照区および LP14添加区を設け、LP14 処理区には 5×10⁷CFU のLP14 を添加した。72 時間培養後、培養上清を回収した。それぞれの培養上清を、段階的に遠心加速度を上げて 3 段階の遠心分離を行った（1 回目：200×g、10 分、2 回目：500×g、10 分、3 回目：2,000×g、10 分、すべて 4℃で実施）。遠心分離後、回収した上清を 0.22 μm フィルターによりろ過した。フィルターろ過した上清を超遠心分離し（120,000×g、1 時間、 4℃）、上清を除去後、沈殿した EVs を PBS で懸濁した。対照区より回収した EVs を LP14(-) EVs、LP14 添加区より回収した EVs を LP14(+) EVs とした。 320123456789細胞外小胞の分泌量細胞外小胞の分泌量は、一般的に細胞外小胞内に含まれるタンパク質量を指標としている。回収した EVs 内に含まれるタンパク質濃度を BCA 法（タカラバイオ）により定量した。細胞外小胞のテトラスパニンファミリーの発現EVs のマーカータンパク質であるテトラスパニンファミリーCD9、CD63、CD81 の発現をウェスタンブロッティング法により定量した。タンパク質量が10 μg になるよう調整した各 EVs を Nu-PAGE ゲル（Invitrogen）に添加し、電気泳動後、ニトロセルロース膜に転写した。一次抗体として抗 CD9、CD63、CD81抗体（R＆D systems）を転写膜に添加し、室温で 1 時間静置した。次いで、HRP 標識の二次抗体を転写膜に添加し、室温で 1 時間静置した。抗体反応後、ECL select（GE Healthcare UK）を使用し、化学発光により標的タンパク質を検出した。細胞外小胞の細胞内取り込みマウス脂肪細胞株である 3T3L1 細胞およびマウス骨格筋細胞株である C2C12 細胞を 96 ウェルプレートおよびカルチャースライド（Watson）に播種し、100％コンフルエントに達するまで DMEM 培地（10%FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン）で培養した。コンフルエントに達した後に、培地をDMEM 培地（1% EVs フリーFBS、ペニシリン/ストレプトマイシン）に置換し16時間培養し、EVsの細胞内取り込み試験に供試した。EVs の細胞内取り込み（Dose test） 上記で回収したマクロファージ由来の EVs をPKH67（Sigma aldrich）で蛍光染色した。96 ウェルプレートで培養した各細胞株にそれぞれ 6 つの試験区を設け、各試験区に 2 倍段階希釈したPKH67 染色 EVs を添加した（0.015625-5 μg/mL）。12 時間の培養後、上清を除去し、PBS で細胞を洗 浄 し た 。 洗 浄 後 、 蛍 光 プ レ ー ト リ ー ダ ー（SH-9000）を用いて、PKH67 の蛍光値を測定した。この際、2 倍段階希釈した PKH67 染色 EVs（0.015625-5 μg/mL）のみを添加したウェルの蛍光値も測定し、検量線を作成した。作成した検量線から細胞内に取り込まれた EVs 量を算出した。 EVs の細胞内取り込み（経時変化） 96 ウェルプレートで培養した各細胞株に 5 μg/mL の PKH67 染色 EVs を添加し、添加後 3、6、9、12 時間後に EVs の細胞内取り込み量を上記の方法により蛍光プレートリーダーで定量した。EVs の細胞内取り込みの観察 カルチャースライドに培養した各細胞株に 5 μg/mL の PKH67 染色 EVs を添加し、12 時間培養した。培養後、上清を除去し、10%ホルマリンを添加した。15 分の静置後、PBS で細胞を洗浄し、VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI(Vector Laboratories)で封入処理及び核染色を施し、蛍光顕微鏡（BZ-X710）で観察した。 統計解析測定値は平均値±標準誤差で示し、群間の差の検定には Graphpad Prism 7 を用いた。独立した2 群間の差の検定は Student t 検定を行った。EVsの取り込み解析では、LP14 刺激の有無およびEVｓ添加量、あるいは LP14 刺激の有無およびEVs 添加後の培養時間の二要因でそれぞれ二元配置分散分析を行った。なお、いずれの場合も有意水準は P<0.05 とした。 結果および考察 細胞外小胞の分泌量およびテトラスパニンファミリータンパク質発現 LP14(+) EVs の分泌量（16.84±2.62 μg/mL）はLP14(-) EVs の分泌量（31.80±2.18 μg/mL）と比較して有意に低い値を示した。この結果から LP14株に刺激されることによって、マクロファージから分泌される EVs 量は減少することが示唆された。 細胞外小胞のテトラスパニンファミリータンパク質の発現解析結果を図 1 に示した。CD81 はLP14(-) EVs および LP14(+) EVs のどちらにおいても発現が確認されなかった。CD9 の発現量はLP14(+) EVs と比較して LP14(-) EVsで発現量が高く、CD63 は LP14(-) EVs でのみ発現が確認された。これらの結果から、マクロファージが LP14に刺激されることにより分泌される細胞膜小胞のテトラスパニンファミリータンパク質 CD9 および330123456789  CD63 の発現が減少することが示唆された。CD9は樹状細胞においてエキソソームの形成に関わっていることが示唆されていることから（ 5）、LP14(-) EVs および LP14(+) EVs の CD9 発現量の差がこれらの EVs の分泌量の差に関係していると考えられる。Segura らは樹状細胞が分泌するEVs の CD9 の発現が、樹状細胞を細菌の炎症誘導分子であるリポ多糖で刺激することによって減少することを報告している（6）。リポ多糖は貪食細胞の表面に存在する Toll like receptor 4（TLR4）によって認識され、NF-κB シグナル伝達系を活性化する（7）。また、乳酸菌の主要な菌体成分であるペプチドグリカンやリポタンパク質は TLR2 のリガンドであり、MyD88 をアダプター分子としてNF-κB シグナル伝達系を活性化する（7Akira et al, 2006）。これらの報告から、LP14 によるマクロファージの NF-κB シグナル伝達系の活性化がEVs の CD9 や CD63 などのテトラスパニンファミリータンパク質の発現を抑制している可能性が考えられる。  細胞外小胞の細胞内取り込み LP14(-) EVs および LP14(+) EVs の 3T3L1 細胞および C2C12 細胞への取り込み量を評価した結果を図2（Dose test）および図3（経時変化）に示した。また、各細胞株への EVs の取り込みを蛍光 顕微鏡で観察した結果を図 4 に示した。LP14(-) EVs および LP14(+) EVs は EVs 添加量に依存し  て脂肪細胞株 3T3L1 細胞および骨格筋細胞株である C2C12 細胞内への EVs 取り込み量は有意に増加した（図 2A、P<0.0001、図 2B、P<0.0001）。また、各細胞株への EVs の取り込みは EVs 添加後の培養時間に依存して増加した（図 3A、P<0.0001、図 3B、P<0.0001）。さらに、LP14(+) EVs の細胞内への取り込み量は 3T3L1 細胞および C2C12 細胞のどちらの細胞株においてもLP14(-) EVs の取り込み量と比較して有意に低かった（図 2A、P<0.0001、図 2B、P=0.0048、図 4）。 この結果から、マクロファージが LP14 に刺激されることで、マクロファージから分泌される EVs は図2 細胞外小胞の細胞内取り込み（Dose test）。(A) 3T3L1細胞内へのEVs取り込み(B) C2C12細胞内へのEVs取り込み0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.50.00.10.20.3EVs amountLP14 (-) EVsLP14 (+) EVsInteraction : P=0.7726Dose : P<0.0001LP14 : P<0.0001(A) 3T3L1図3 細胞外小胞の細胞内取り込み（経時変化）。(A) 3T3L1細胞内へのEVs取り込み(B) C2C12細胞内へのEVs取り込み3 6 9 1201234Incubation time (h)LP14 (-) EVsLP14 (+) EVsInteraction : P=0.3576Dose : P<0.0001LP14 : P=0.0020(A) 3T3L1340123456789  脂肪細胞および骨格筋細胞に取り込まれにくくなることが示唆された。Escrevente らは、卵巣がん細胞への EVs の取り込みに EVs の膜表面に存在するタンパク質が関係していることを報告している（8）。本研究においても、LP14(+) EVs は LP14(-) EVs と比較して EVs 表面タンパク質のひとつである CD9 および CD63 の発現が減少していた（図 1）。LP14 の刺激によってマクロファージが分泌した EVs の細胞内取り込みが減少する詳細な機序は依然として不明であるが、CD9 および CD63 などの EVs 表面タンパク質がこの現象に関係している可能性がある。  ［文献］ 1. Raposo, G., & Stoorvogel, W. (2013). Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol, 200(4), 373-383. 2. Valadi, H., Ekström, K., Bossios, A., Sjöstrand, M., Lee, J. J., & Lötvall, J. O. (2007). Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature cell biology, 9(6), 654.  3. Zhang, Y., Shi, L., Mei, H., Zhang, J., Zhu, Y., Han, X., & Zhu, D. (2015). Inflamed macrophage microvesicles induce insulin resistance in human adipocytes. Nutrition & metabolism, 12(1), 21.  4. Matsumoto, S., Hara, T., Hori, T., Mitsuyama, K., Nagaoka, M., Tomiyasu, N., Suzuki, A., & Sata, M. (2005). Probiotic Lactobacillusinduced improvement in murine chronic inflammatory bowel disease is associated with the downregulation of proinflammatory cytokines in lamina propria mononuclear cells. Clinical & Experimental Immunology, 140(3), 417-426. 5. Wong, W. (2010). Exit by Exosome. Sci. Signal., 3(141), ec294-ec294.  6. Segura, E., Nicco, C., Lombard, B., Véron, P., Raposo, G., Batteux, F., Amigorena, S., & Théry, C. (2005). ICAM-1 on exosomes from mature dendritic cells is critical for efficient naive T-cell priming. Blood, 106(1), 216-223.  7. Akira, S., & Takeda, K. (2004). Toll-like receptor signalling. Nature reviews immunology, 4(7), 499-511.  8. Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., & Costa, J. (2011). Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells. BMC cancer, 11(1), 108.    350123456789

http://ousar.lib.okayama-u.ac.jp/files/public/5/56029/2018052217144246840/poalas_034_032.pdf

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