We observed adiamycin (ADR) uptake and cellular transmembrane potential [amount of intracellular fluorescence of 3,3'- (Di-n-hexyl)- 2,2'- oxacarbocyanine iodide (NK-2280)] in ADR-resistant cells established from Ehrlich ascites tumor cells (EATC) and wild type EATC. In ADR-resistant cells, ADR uptake and the cellular transmembrane potential decreased as the degree of resistance increased. 4,4'- diisothiocyanatostilbene- 2,2'- disulfonic acid (DIDS) induced markedly decreases of ADR uptake and the cellular transmembrane potential. A good correlation was observed between ADR uptake and transmembrane potential in cultured cells

Asaumi, Jun-ichi

Hiraki, Yoshio

Kawasaki, Shoji

Kuroda, Masahiro

Nishikawa, Koji

Shu Gao, Xian

Okayama University Scientific Achievement Repository

岡大医短紀要,3:81-85,1992Bul.Sch.HealthS°i.OkayamaUniv.薬剤耐性細胞におけるアドリアマイシンの細胞内取り込みと細胞膜電位差の相関浅 海 淳 - 1)･川 崎 祥 二2)･西 川 光 治1)･高 献 書1)･黒 田 昌 宏1)･平 木 祥 夫1)RelationshipbetweenintracelularuptakeofadriamycinandmembranepotentialinADRresistantEhrlichascitestumorcelsJun-ichiAsAUMIl),ShojiKAWASAKI2),KojiNISHIKAWAl),MasahiroKURODAl),XianSHUGAOl),andYoshioHIRAKIl)WeobseⅣedadiamycin(ADR)uptakeandcelulartransmembranepotential[amountofintracelularfluorescenceof3,3'-(Di-n-hexyl)-2,2'-oXacarbocyanineiodide(NK-2280)] inADR-resistantcelsestablishedfromEhrlichascitestumorcels(EATC)andwildtypeEATC.InADR-resistantcels,ADRuptakeandthecelulartransmembranepotentialdecreasedasthedegreeofresistanceincreased.4,4'-disothiocyanatostilbene-2,2'-disulfonicacid(DIDS)inducedmarkedlydecreasesofADRuptakeandthecelulartransmembranepotential.AgoodcorrelationwasobservedbetweenADRuptakeandtransmembranepotentialinculturedcels.KeyWords:Adriamycin,CelMembranePotential,FlowCytometry,ADR-ResistantCels,DIDS1.緒 言今日,癌化学療法を重ねる度に効果が低下する現象がみられ,癌細胞が抗癌剤に耐性を獲得することが問題になっている｡そして,ある抗癌剤に耐1性を獲得した癌細胞は他のいくつかの抗癌剤に耐性 を獲得している多剤耐性を示すことが報告されている1),2)｡また,adriamycin(ADR)は高頻度に用いられる抗癌剤で,二重鎖DNAの塩基間にintercalateL,DNAの転写および複製機能を阻害するanthracycline系の抗生物質である3),ADRに対して耐性を獲得した細胞は,その細胞膜にいくつかの特殊タンパク質を合成しており1)･4ト 7),中でも170kDaのp-glycoprotein(p-gp)は細胞内に流入したADRを排壮する機能を持つタンパク質である1),2),8)0一万,3,3'-(Dトn-hexyl)-2,2'-oXacarbo-1)岡山大学医学部放射線医学教室2)岡山大学医療技術短期大学部診療放射線技術学科cyanineiodide (NK-2280)は細胞膜電位に関連して吸着したり,取込まれたりする蛍光物質である9),10)｡著者らは,薬剤耐性を克服する目的でエールリッヒ腹水癌 (EATC)からADRに耐性を持つcellineを樹立した｡今回,著者らはこのADR耐性細胞とその親株 (wildtypeEATC)を使用し,ADRおよびNK-2280の取込みの関係について検討した｡2.材料と方法1)細胞および培養細胞はエールリッヒ腹水癌細胞 (EATC)を使用した｡EATCより0.2,0.5,1,5,10/Jg/mlの濃度のADRを含む培養液中で増殖可能を細胞 (0.2-,0.5-,1-,5-,10-〃g-ADR-resistantEATC)をー 81-浅海 淳一他樹立した｡継代培養はDulbecco'smodifiedEaglemedium(DMEM)(日水製薬)にpeniciline(100単位/ml),streptomycin(100/Jg/ml)(明治製菓)および10%calfserum (斑yclone)を添加した培養液を使用し,37.0℃にて5% Co∑+95% airのCO2incubatorで行った｡ADR-resistantEATCはそれぞれの濃度のADRを含む培養液中で継代培養し,実験には,1週間前よりADRを含まない培養液中で培養した細胞を使用した｡2)薬剤ADR (協和発酵),4,4'-disothiocyanatostil-bene-2,2'-disulfonicacid(DIDS)(Sigma)は蒸留水に溶解し,冷凍保有したものを実験の都度解凍し直ちに使用した｡DIDSの使用濃度は0.5mMであった｡3,3㌧(Di-n-hexyl)-2,2'-oXacar-bocyanineiodide(NK-2280)(日本感光色素研究所)は99.5%ethanolに溶解し,使用時に濃度調節を行った｡ADR及びNK-2280の使用実験はye1-lowlight下で行った｡3)ADR取り込みの測定ADRは488nmで励起すると556nmと582nmにピークをもつ蛍光を発する蛍光物質であることから,Flowcytometry(FCM)を用いて細胞1個当たりの細胞内蛍光量を測定した｡細胞内ADR測定は,細胞を25cm27ラスコ (Falcon)に播種 し,37℃温水中に直接浸けた｡ADRの反応濃度は10〝g/mlで,反応時間は60分であった｡ADR処理後細胞を遠心し,冷PBSで洗液し,0℃ (氷中)に保ち,40Jmナイロンメッシュで漉過した｡FCMはEPICSPROFILEIIを用い,488mmで励起し,530nm以上の蛍光量を20,000個の細胞で測定したO得られたヒストグラムから細胞1個当たりの平均蛍光量を求め,この値よりコントロール (ADR非処理)の細胞の平均蛍光量 (細胞の自然蛍光)を差し引いた量を平均細胞内ADR量とした11)~13)｡4)NK-2280取り込みの測定NK-2280は488nmで励起すると495nmにピークをもつ蛍光物質であることから,488nmで励起し,500nm以上の蛍光量を測定した14)0 NK-2280の取り込みはADRと同様の方法で行った｡NK-2280の濃度は,0.6〟Mであり,反応時間は20分間であった｡5)反応液NK-2280とADRの取 り込みの実験に使用した反応液は上記培養液 (10%仔牛血清を含む)にそれぞれの濃度に成るように薬剤を加えた｡3.結 果1)ADR耐性細胞のNK-2280とADRの細胞内取り込みEATCの親株 (wildtype)とADRに耐性の細胞5種類 (0.2-,0.5-,1-,10-〟g-ADR-resistantEATC)を使用し,NK-2280及びADRの取り込みを観察した｡???????? ???????????? ???? ? ????A a C D E F図1 アドリアマイシン(ADR)に対する耐性度と細胞膜電位の関係A: wildtype,B:0.2JLg/ml,C:0.5JLg/ml,D･'1JLg/ml,Eニ5/Jg/ml,F･'10pg/mlのADR濃度で増殖するEhrlichascitestumorcels(EATC)耐性細胞を使用した｡細胞をNK-2280(0.6JM)20分間,37℃の条件下で処理し,NK-2280の細胞内取り込みをFCMにて測定したADR耐性細胞のNK-2280の取 り込みはwild-type EATCと比較して減少を示した (図 1)0wildtypeEATCの取り込みを100%とすれば,0.2-〟g-ADR-resistantEATCでは21%であった｡ADR耐性細胞の中でADRに対する耐性度の高い細胞 (ADR濃度の高い状態で維持培養している細胞)はどNK-2280の取り込みは減少していた｡- 82-ADR取り込みと細胞膜電位?????? ????????? ???? ? ? ????A B C D E F図2 各種アドリアマイシン(ADR)耐性細胞のADRの細胞内取り込みA:wildtype,B:0.2Jg/ml,C:0.5Jg/ml,I):1FEg/mi,E:5/′g/ml,F:10FLg/mlのADR濃度で増殖するEhrlichascitestumorcels(EATC)耐性細胞を使用した｡細胞をADR(10/`g/ml)60分間,37℃の条件下で処理し,ADRの細胞内取り込みをFCMにて測定したADRの取り込みは図 2に示すようにwildtypeEATCの取り込みを100%とすれば,0.2一〟g-ADR-resistantEATCでは27%であった00.5-,ト,5-,10-FEg-ADR-resistantEATCではそれぞれ22,24,18,18%であった｡NK-2280と同様にADR耐性細胞の中でADRに対する耐性度の高い細胞ほどADRの取込みは減少を示した｡2)NK-2280及びADRの細胞内取 り込みに対するDIDSの影響Wild type EATC及び耐性細胞として1-〃g-resistant EATCを用いた｡前述の実験条件にDIDS加え,NK-2280とADR取 り込みに対するDIDSの作用を観察した｡DIDSを加えるとADR及びNK-2280の取 り込みは抑制された｡DIDSを加えるとADRの取り込みはwildtypeEATCでは34%,耐性細胞では25%であった｡NK-2280の取り込みはwildtypeでは55%,耐性細胞では55%であった｡両細胞ともにDIDSによってNK-2280及びADRの取 り込みは有意に減少していた (p<0.01)(図3)0???? ??? ? ?? ?? ? ? ? ? ?? ??? ? ?? ?? ? ?? ????? ???? ????? ??? ?? ? ????? ? ?? ?? ??図 3 NK-2280とADRの細胞内取り込みに対するDIDSの効果細胞はWildtypeEhrlichascitestumorcels(EATC)と卜〃g-ADRresistantEATCを使用した｡A:wildtypeEATCwithoutDIDSB:wildtypeEATCwithDIDSC二1-〟g-ADR resistantEATC withoutDIDSD:1-〟g-ADRresistantEATCwithDIDS左図:NK-2280の取り込み,右図:ADRの取り込み4.考 察ADRは,生理的条件下では陽性に荷電していることから,ADRの取り込みは常に陰性に荷電している細胞膜電位差に影響されると考えられている14ト17)｡一方,NK-2280は細胞の膜電位に関連して吸着したり,取り込まれたりする蛍光物質である9),10)0今回,著者らはEATCから樹立した5種類のADRに耐性の細胞とその親株を用いて,NK-2280とADRの取 り込みを測定 し,細胞膜電位差 とADRの取り込みとの関係について検討した｡WildtypeEATC,0.2-,0.5-,ll,5-,10-JLg-ADR-resistantEATCとADRに耐性度の高い(濃い濃度のADRを含む培養液中で培養した細脂)はどNK-2280とADRともに取り込みは減少し(撰1,2),両者はよく相関していたO強い耐性をもつ細胞ほど膜電位差が少ないこと,排推力が大きいこと,あるいは両者が考えられた｡従って,臨床上での癌細胞の制ガン剤に対する耐性度を知る上の指標としてNK-2280の取 り込みを測定することは有用であることを示唆している｡- 83-浅海 淳一他一方,DIDSの作用はHCO3-/C1-exchangeの阻害18)やCa2十ポンプの不活性化19)することが知られている.図3に示すように,DIDSによりNK-2280とADRの取り込みはともに著明に減少し (p<0.01),やはり両者はよく相関を示した｡従来,ADRの細胞内取り込みは受動輸送によると考えられていたが,DIDSによりADRの細胞内取 り込みを抑制することができることから,ADRの細胞内流入は細胞の生理学的環境に影響されることを示唆している｡著者らの結果からADRの流入にはDIDSにより膜電位差が減少したこと,あるいは塩素イオンポンプの変化20)により影響されていると考えられる｡ADRの細胞内流入に及ぼす生理学的因子を明らかにすることは,化学療法において薬剤耐性の発現機構を明らかにするうえで重要なことと考えられ,今後検討を加えたい｡5.謝 辞本研究は,文部省研究費がん特別研究 (01010026,02151022,03151022),奨励研究 (602850225306),平成 4年度文部省特定研究経費の援助を受けた｡文 献1)Bradley,G.,Juranka,P.F.andLing,V.:Mechanismofmultidrugresistance.Biochim.Biophys.Acta,948:87-128,19882)Tsuruo,T∴Mechanismsofmultidmgresistanceandimplicationsfortherapy.Jpn.∫.CancerRes.(Gann)79:285-296,19883)Zunino,F.,Gambeta,R.,DiMarco,A.andZaccara,A∴InteractionofdaunomycinanditsderivativeswithDNA.Biochim.Biophys.Acta,277:489-498,19724)Hamada,H.,Okochi,E.,Oh-hara,T.andTsuruo,T.:PurificationoftheMr22,000calcium-bindingprotein(sorcin)associatedwithmultidmgresis-tanceanditsdetectionwithmonoclonalantibodies.CancerRes.48:3173-3178,19885)Sugawara,I.,Ohkochi,E.,Hamada,HリTsuruO,T.andMori,S.:CelularandtissuedistributionofMRK20murinemonoclonal antibody-defined85-kDaproteininadriamycin-resistantcancercellines.Jpn.∫.CancerRes.(GANN)79:1101-1110,19886)Hamada,H.,Okochi,E.,Watanabe,M.,01卜hara,T.,Sugimoto,V.,Kawabata,H.andTsuruo,T.:Mr85,000membraneproteinspecificalyexpressedinadriamycin-resistanthumantumorcels.CancerRes.48:7082-7087,19887)Deuhars,K.L andLing,Ⅴ∴p-glycoproteinandmultidrugresistanceincancerchemotherapy.Semi,Oncol.16:156-165,19898)Kessel,D.andWilberding,C∴Anthracyclineresis-tanceinP388murineleukemiaanditscircumven-tionbycalciumantagonists.CancerRes.45:1687-1691,19859)Hoffman,∫.F.andLaris,P.C.:DeteminationofmembranepotentialsinhumanandamPhium redbloodcelsbymeansofafluorescentprobe.∫.Physiol.239:519-552,197410)Cohen,L.B.,Salzberg,B.M.,Davila,H.V.,Ros,W.N.,Landowne,D.,Waggoner,A.S.andWang,C.H.:Changesinaxonfluorescenceduringactiv-ity:molecularprobesofmembranepotential.∫.MembraneBiol.19:1-36,1974ll)Krishan,A.and Ganapathi,R∴ Laser flowcytometricstudiesontheintracelularfluorescenceofanthral:yClines.CancerRes.40:3895-3900,198012)Durand,良.E.andOliveP.L∴Flow cytometrystudiesofintracelularadriamycininsinglecelsinvitrD.CancerRes.41:3489-3494,198113)Muirhead,K.A.Schmitt,T.C.andMuirhead,A.R.:Determinationoflinearfluorescenceintensitiesfromflowcytometricdataaccumulatedwithlogar-ithmicamplifiers.Cytometry,3:251-256,198314)Asaumi,I"Kawasaki,S.,Nishikawa,K.,Kuroda,M.andHiraki,Y∴EffectofmembranepotentialontheamountofAdriamycinuptake.(unpublished)15)Lampidis,T.J.,Hassan,Ⅴ.,Weiss,M.J.andChen,L B∴Selectivekilingofcarcinomacels<invitro>bylipophiliccationiccompounds:Acelu-1arbasis.Biochem.Phamacol.39:229-226,198516)Tapiero,H.,Boule,D.,Trincal,G"Fourcade,A.andLampidis,T.J∴Potentiationofadriamycinaccumulationandeffectivenessinadriamycinresis-tantcelsbyaclacinomycinA.LeukemiaRes.12:411-418,198817)Hasmann,M"Valat,G.K.,Tapiero,H.,Trevorrow,K.andLampidis,T∴Membranepotentialdiffer-encesbetweenadriamycin-sensitiveand-resistantcelsasmeasuredbyflow cytometry.Biochem.Pharmacol.38:305-312,198918)Nishiyama,M.,Horichi,N.,Mazouzi,ZリBungo,M.,Saijo,N.andTapiero,H∴Cancytotoxicactiv-ityofanthracyclinesberelatedtoDNAdamage?AnticancerDrugDesign5:135-139,1990- 84-ADR取り込みと細胞膜電位19)Zhuang,V.,CragoeJr,E.J.,Shaikewitz,T"Glaser,L.andCassel,D∴CbaracteTizationofpotentNa+/H+exchangeinhibitorsfromtheamilorideseriesinA431cels,Biochemistry23,4481-4488,198420)森井浩世 :細胞膜のカルシウムポンプ.ClinicalCa1-cium2,100-101,192221)Asaumi,J.,Kawasaki,S.,Nishikawa,K.,Kuroda,M.andHiraki,Y∴ ModulationofAdriamycinuptakeandretentionbymetabolicinhibitorsandionregulationinhibitors.(unpublished)(1992年10月30受理)- 85-

Relationship between intracellular uptake of adriamycin and membrane potential in ADR resistant Ehrlich ascites tumor cells

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