Miyazaki, Yoshimitsu

ミヤザキ, ヨシミツ

佐賀大学農学部生物化学研究室

宮崎, 芳光

Saga University Institutional Repository

佐大農業 31:49～55 (1971) 
チクロヘプタグルカン（ベーターシャルデ、インガーデキスト
リン〉沃素複合体の性質とその比色定量法について＊
宮崎芳光
（生物化学研究室）
昭和45年 12月28日受理
Quality of Cycloheptaglucan （βーSchardingerDextrin) 
Iodine Complex and Its Colorimetry 
Y oshimitsu M1v AZAKI 
(Laboratory of Biochemistry) 
Received December 28, 1970 
Summary 
The colorimetric determination was carried out for cycloheptaglucan-iodine complex. 
One thousandth normality of iodine solution was added to the sample solution until the 
volume became three times, and optical density was determined at 400 mp against the blank. 
The error was within plus or minus four per cent. 
The results obtained by this iodine method almost agree with those by the measurement 
of reducing power with 3, 5-dinitrosalicylic acid reagent in the determination of cyclo-
heptaglucan digested with Taka-amylase A. 
Dissociation constant of this complex was found to be 5. 3×10-4 in graphing according to 
assumption of the formation mechanism of the complex. 
チクロへプタグノレカン（CHG）が沃素と黄色の複合体を形成することは， French1lにより知ら
れていたが，詳細！念報告はない． また CHGの定量法として Tildenらの検鏡法があるが， これ
に二三の難点のあることは Frenchが指摘した通りである．そこで，この複合体の性質を調べ，
酵素反応時にかける条件下での比色法を設定した． また，タカアミラーゼ、 A(TAA）の CHGに
対する作用をこの定量法と3,5－ジニトロサリチル酸を用いた還元力の定量法によって測定し，比
較検討した．
実験試料
1) チクロへプタグルカン（CHG): このデキストリンは， Bacillusmaceransをデンプンに
作用させた時に，ヘキサ，へプタ，オクタ，等の混合物として得られる．分離法は Frenchによ
り研究され，改良法が河野bよび二国2）により報告されている． この実験に供した CHGは，粗
結晶を更に精製して用いた． その過程を Scheme1.に示す． デキストリン，有機溶媒複合体の
生成を Frenchは一般に，全溶液の1/8容のプロモベンゼンを添加して行まっているが，河野ら
の報告では，全液量の1/50容のプロモベンゼンで（へプタ＋オクタ）区分が完全に沈澱したと
＊本報告の大要は日本農芸化学会全国大会で発表した.(1968年，於名古屋）
50 佐賀大学農学実報第 31号（1971)
Scheme 1. Purification of Cycloheptaglucan. 
Crude crystal of CHG (20g) l d凶o叫
↓ at room temp. 
Solution 
I ad白d加 moben
白Iter.
↓↓ 
Prモcipitate(Hepta+Octa type) Filtrate (I王exatype) l出sぬlvedin dis 
(rモpeatedthis treatment until bromober】zeneeliminat疋 completely)
Dried material 
l…一…訂σ0ml), cooled at room temp., then filtrated 
↓ 
Crystal (Hepta type) Filtrat疋（Octatype) l repeated previous treatment 
Recrystal 
考えられる．またプロモベンゼ、ンの水に対する溶解度は約0.45g/lであるから，本実験では1/100
容を使用した．
CHGの純度を Table1に示す．
Table 1. Purity of Cycloheptaglucan. 
water content ［日］ 590mμ reducing suger1l nitrogen2l content content 
（%） (C=l, water) (% maltose) （%） 
14. 1 164。 0. 13 0.003 
1) Somogyi・Nelsonmethod. 2) micro-Kjeldahl method. 
2) タカアミラーゼ A(TAA): 三共のタカジアスターゼから池中3）の方法により，分離，再
結晶して精製したものである． このものはディスク電気泳動で単一のバンドを示し， 不破法4）に
よる D.P.（糊精化力）は 500/rタンパク N，また M.U.値7）は2.873である．
実験結果および考察
1. 複合体による呈色の測定条件の検討および検量線
酵素タンパクの存在下にまfける，複合体の測定を目的としていたので，波長400mμ 附近の沃
素溶液たよび複合体の吸収スペクトノレを測定した． その結果を Fig.1に示す． 図に示す様に，
400mμ に沿いて LJO.D.（複合体溶液と沃素溶液の opticaldensityの差）が大きいので，以下の
実験には波長 400mμ を使用した．
沃素溶液の濃度が， LlO.D.に及ぼす影響をみるために， 沃素溶液の濃度を変えて， LlO.D.を
測定すると Fig.2のようを結果となった． 0. OOlN～0. 0005N溶液が測定に良好である．
複合体の呈色の時間安定性をみたのがFig.3であり，キャップをかぶせてbけば60分聞は安
51 宮崎：チクロヘプタグノレカン沃素複合体の性質とその比色定量法について
はτ
3 
2 
1 
．?
．?
420 
・ー I 0.00 IN iodine sol. 4 ml 
I distilled water 2 ml 
400 
Wave lenghth mμ 
Fig. 1. Optical Density of CHG Complex with Iodine, and Iodine 
Solution versus Wave Length. 
×ー－ I 0.OOlN iodine sol. 4ml 
I CHG sol.(!%) lml 
I distilled water 1 ml 
cell: !Omm, cont: distilled water. 
380 
・ー－ -.‘・．
司・ － ー ー’ー
1.0 
0.8 
、丸
E 
0 
0 
申
凸
ci 0.6 
< 
a・ ・ a ．・ ． 
’ ，『F
0.2「
0 I j I I 
20 40 60 
1.0 
0.8 
0.6 
0.4 
?? ?
?．?． 。
?
0.2 
mm 
Fig. 3. LIO. D. 400mμ of CHG Complexs with 
Iodine versus Times. 
。
5 
CHG mg/ml 
Fig. 2. LI 0. D. 400mμ of CHG Complexs with 
Iodine versus Amounts of CHG. 
2 
400mμ を縦軸に取った検量線を
定である．
試料溶液 1ml中の CHGの mg量を横軸に取り LIO.D.,
第31号（1971)
Fig.4に示す． この際，試料溶液に対する，添加沃素溶液の容量比は常に1: 2である． 検量線
からわかるように，比色測定の場合， CHGの量は試料溶液 lmlあたり 5mg以下が好ましく，
濃い場合は，予め試料溶液を稀釈して測定するとよい．
佐賀大学農学業報52 
1.0 
0.8 
E 
0 
0 
司ヂ。0.6
0 
<J 
0.4 
0.2 
6 8 10 
CHG mg 'Samp. Sol. ml 
Fig. 4. Standard Curve of CHG Complex with Iodine. 
．ーー： 0.OOIN iodine sol.；ー ×ー： 0.0005N iodine 
sol. cell: IO mm. 
2 。
2. 複合体の解離定数の推定
Fig. 4の曲線から，複合体と遊離体は平衡系を形作っていると考えられるので，複合体濃度が
JO.D. 400mμ に比例すると仮定して，解離定数を求めてみた．
Ks 
12十G士二12・G
、 、 ， ???? ???．．?．?．?
A: LIO.D. 400mp, K，：複合体の解離定数，
即ち，
ここで， 12：沃素， G: CHG, 12・G：複合体，
k：比例定数と表わせば，
〔GJ＞〔ん］
〔12-kA][G] 
kA 
〔Iz・G]=kA又，
〔ん－I2・G〕〔G]
[/2 ・G] 
仮定より，
1 Ks 1 一 一一. kA -[/2] [G] I [/2ユ
Ks= 
「?
? 「
?
?
｛? ?
「 ｜ 」 ? 「
?
?? ?
??? ?
従って，
1 _Ks・k 1 I k 
A U2l [G] ' TI2] 
・・・・・・・・・（2)
〔G〕 k Ks・k 一一二一一一回ユ＋一一－A [/2] [/2] ・・田・・・・・・（3)
のとき[G〕－＂A 》従って
宮崎：チクロヘプタグノレカン沃素複合体の性質とその比色定量法について 53 
k Ks・k 
ーごと ・〔G〕＝一
[I2] [I2〕
[G]=-Ks ..... (4) 
[G］、 F
(3）式から十互一，［GJ，を両軸として作図し［GJl謝！と直線の交点から解離定数は求められる．
作図の結果を Fig.5に示す．図の CHG低濃度部にbいての，直線からのずれは［GJ》 U2Jの
不成立のためであると考えられる． 解離定数が， 沃素濃度に無関係をのは（4）式から明らかであ
る図から複合体の解離定数を， 5.3×10-4と推定した．
0 -x 
E 
g 
宅ヨド
ロ。
寸、
5.90 
~ 2.95 
仁コ
国
巳』
。 1.47 2.94 
CHG×JO'M 
Fig. 5. CHG/ LlO. D. 400mμ versus CHG Plot, which is introduced from Data 
shown in Fig. 4. 
×ーー： 0.0005N iodine solution，ー e-:0. OOOIN iodine solution. 
3. 複合体による呈色に及ぼす緩衝液の影響
緩衝液の種類ゐ、よび濃度が呈色に与える影響を Table2に示す． Mell vain緩衝液は呈色を大
Table 2. Changes in LlO.D. 400mr~ due to the Formation of Complex of 
Cycloheptaglucan with Iodine under Various Conditions. 
kinds Acetate Mcilvain 
Buffer conc. 0.05M 0.2M 0.5I¥在 0.05M 0.05乱f
(Im/) pH 4. 7 5.3 5.85 5.85 5.5 6.0 
CHG(!%, ml) 
Iodine 0. 001 N (ml) 4 4 4 
.dO.D. 400 mμ 0.830 0.835 0.839 0.835 -0.31 
きく乱す．このことはこの複合体が，沃素，アミローズ複合体と同様に，沃素が電子受体となりの，
いわゆる，電荷移動複合体を形成しているため，この緩衝液の成分であるクエン酸が，電子供与
体として作用し複合体形成を妨げた結果と考えられる．酢酸ナトリウム緩衝液は，供試濃度む
54 佐賀大学農学業報第31号 (1971)
よびpHの範囲内では影響を及ぼしてい念い．
Table 3には，酢酸緩衝液の各濃度での実験誤差を求めた結果を示す．最大土4%の測定誤差
が存在する．
Table 3. Formation of Cycloheptaglucan Complex with Iodine in a Given Ratio by Volume. 
Sample Acetate I （山5) 0.5M 0.05M 0.5M 0.5M 0. 51¥在
solution buπer (mi) 0.5 0.5 2 
CHG (1%,mi) 0.5 0.5 0.5 
Iodine 0. 001 N (ml) 2 2 3 4 2 6 
CHG mg (found) 5.1 5.2 4.8 10.0 9.8 10.2 
CHG mg (calcu) 5.0 5.0 5.0 10.0 10.0 10.0 
Error ( o/o) +2 +4 -4 。 -4 十2
4. CHGのTAAによる分解の測定
CHGのTAAによる消化の様子を， 時間を画数として，沃素比色法と還元力測定法の両法で
測定し比較検討した結果がFig.6である．横取iは時間を示し縦nq1は，沃素法では CHGの消
F百
也B
" ＂.百「ロ ω。＃
』 VJ
mg 
6 
品~ 4. 
2宅－
.8 0 
一話回
2υ 
2 
0 30 60 90 120 
mm 
Fig. 6. Digestion of CHG by T AA. 
×ーー： CHGdigested; 
．ーー： Maltoseproduced (3, 5-dinitrosalicylic acid) 
質量， 還元カ測定法では 3,5ジニトロサリチJレ酸を用いて， 生成物をマノレトーズと仮定して算
出した量であり，共に mgで示しである．反応開始後，やや還元力測定法による数値が低いが，
H年聞の経過と共に一致してくる．これは反応開始直後の生成物であるマノレトテトラオーズが漸次
低分子のマノレトーズに変化するためと考えられるの． しかしながら，両測定値は非常によく似て
むり， CHGのTAAによる分解を測定するには，試薬の安定性からみて，還元力測定法が有利
であろう．ただし 3,5－ジニトロサリチノレ酸による比色法では，比色の条件を検量級作製の場合
と同一にせねば，測定値が信頼出来てといことに留意する必要がある．
本研究を行なうに当って，チクロヘプタグノレカンの粗結晶を頂いた，二国二郎教授，福井俊郎
教授に深甚の謝意を表する．
宮崎：チクロへプタグノレカン沃素複合体の性質とその比色定量法について 55 
摘要
チクロへプタグルカンと沃素の複合体の性質を調べ，比色法による CHGの定量法を設定した．
すなわち， 試料溶液1容に， 0.OOlN沃素溶液2容を加え，ブランクを対照として，光学密度を
400mμ で測定し検量線から算出する．測定誤差は± 4；；ぢ以内である.CHGのTAAによる消
化を，この定量法と還元カ測定法によって比較測定したところ，殆んど一致した結果を得た．ま
たこの複合体の解離定数を， 5.3×10-4と推定した．
文献
1) FRENCH D.: Advances in carbohydrate chemistry, 12, 189(1957) 
2) 河野啓一・二国二郎：澱粉工業学会誌 9,23 (1961) 
3) 池中徳治：；蛋白質核酸酵素 6, 227 (1961) 
4) FuwA, H.: Jour. Biochem. 41, 583(1954) 
5) 八木一文：食品化学の基礎p.77共立出版(1963)
6) 宮崎芳光：日農化西日本支部大会講演（1967)
7) MATSUBARA, H.・IKENAKA,T.・AKABORI,S.: Jour. Biochem. 46, 425 (1959) 


チクロヘプタグルカン　ベーターシャルディンガーデキストリン　ヨウソ　フクゴウ　タイ　ノ　セイシツ　ト　ソノ　ヒショク　テイリョウ　ホウ　ニツイテ

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