Fujii, Minoru

Harada, Katsuhiko

Matsuda, Makoto

ハラダ, カツヒコ

フジイ, ミノル

マツダ, マコト

三和澱粉工業株式会社

佐賀大学農学部生物化学研究室

原田, 勝彦

松田, 真

水産大学校

藤井, 実

Saga University Institutional Repository

佐賀大学農学業報第23号 27～31 
システィンおよびク、、ルタチオン（還元型）
の分離定量法について
藤井 実・原田勝彦＊．松田 真料
On the Separation and Titration of Cysteine and 
Glutathione from Mixture of Them 
By 
Minoru FUJII, Katsuhiko HARADA and Makoto MATSUDA 
Sununary 
The authors found that cysteine reacted to pu妊erpoison, tetrodotoxin, that was con・
旬inedin the extraction from liver and ovaria of swell fish (Fugu rubipes rubipes), 
reductively and additively, but glutathione reacted not. By using this counteraction of 
cysteine to tetrodotoxin, we succeeded to titrate glutathione (GSH) selectively from 
mixture of cysteine and glutathione. 
The procedure runs as follows. 
Mixture is added with reagent solution contained tetrodotoxin and controlled to pH 7 
using bu妊ersolution (Mc IL VAINE), and incubated at 40℃ for 5 minutes. Then, 
cysteine is excepted outside of reaction by means of formation probably additive com・
pounds of cysteine with tetrodotoxin, so that glutathione can be safely titrated with 
KI03 solution (M/600～M/1200) iodimetrically. 
Cysteine can be calculated from the value of titration of blank test, that is observed 
in the case of non-adding reagent solution, tetrodotoxin, to mixture. 
Department of Agricultural Chemistry 
Faculty of Agriculture 
Saga University 
Saga Japan 
システィンおよびグルタチオン（還元型 ・GSHと略）は生体内にあって，生体内の酸化還元反
応K大きな役割を占めるといわれているが，両者共に分子内ICSH基を有し，乙の基が還元反応
lと関与しているのであるから両者の分離定量は簡単ではない．著者の一人（藤井）は亜硫酸塩を
使用してフグ毒解毒を行ない，その解毒の機構を明らかにしたl_そこでフグ体内（トラフグ）に
＊ 水産大学校勤務
林三和澱粉工業株式会社勤務
28 佐賀大学農学業報第23号
おける解毒機構解明の為，フグ肝臓の成分を分析し，相当量の遊離システィンが存在することを
確認した．そしてとのシスティンが亜硫酸塩と周様な化学反応を行なってテトロドトキシン溶液
を中和解毒することを知った2）.そ乙でこの反応性を利用して，システィン，グノレタチオン（GSH)
混合溶液にテトロドトキシン含有溶液を添加し，ジスティンと反応させ，グノレタチオン（GSH）を
分離し定量することが出来るのでないかと考え，実験を行ない，好結果を得た．
実験および結果
1.試料の調製
I 1 テトロドトキシン溶液（TT一法液と略）の調製
TT一溶度の調製は平田等3）の方法にしたがった．すなわち生鮮または乾燥粉末としたトラフグ
卵巣に水を加えて抽出溶液を得，これに AmberliteIRC-50 (NH4－型）を加えてアンモニヤアル
カリ性（pH9）溶液中で吸着を行なう．次lと吸着IRC-50K酢酸を加えて pH4で溶離し，溶離
溶液を減圧濃縮して TT－溶液とした．
l-2 システィン（CySH）溶液の調製
シスチン O.lgを lMー クエン酸！溶液IL溶かし pHを1とし亜鉛末 lgを加えて3分間加熱
煮沸した後， 40°CIL I時間放置し，漉過洗厳し洗液を合せて IOOmlにする．
I a グノレタチオン（GSH）溶液の調製
GSHは和光純薬工業KKの特級（還元型）を使用した溶液（136mg/dl）を適宜に稀釈使用した．
2. CySHの定量法の検討
Cy SHの消定定it法は奥田法5）にしたがったがさらに次の如く一部改変した．すなわち CySH 
溶液一定量IC5 ~ぢ KI 溶液 5ml および 2~ぢ澱粉治波数摘を加え，さら l乙 5Mーメタリン酸溶液を加
えて pHを1となし冷却する．乙の変法が正確な結果恋与えるか否かを検討して次の様な結果を
得た．
Table I. Titration value of Kl03 solution for cysteine of various concentration 
CySH (ml) (0. lg/dl) 
Titration value of KI03 (M/600) 
Recovery ( % ) 
o. 125 0. 250 0. 500 I. 000 2. 000 
o. 105 0. 223 0. 456 0. 889 I. 802 
100. 9 107. 2 109. 6 106. 9 108. 3 
表1の結果を図示すると図1の知くなった．
すなわち表1および図1の結果はシスチンからシスティンへの還元は完全に行なわれており，
また上述の滴定方法により充分満足すべき結果を与えることを示している．ただ滴定結果が 100
%をオーバした点についてさらに実験を重ねた結果，常に 100~ぢ前後の価を得たので，との条件
で実験を進めた．
3. CySH, GSHとTT一溶液の反応に及ぼす温度， pH，反応時間等の影響
3-1 温度の影響
CySH, GSHの一定量KTT一溶液を 5ml添加し IM一重炭酸ソーダ溶液で pHを7～7.4IC調
整しさらに pH7の緩衝溶液（MCILVAINE緩衝溶液）を一定量加えて o.15, 25. 35および40
の各温度（。C）で反応させる．反応後5Mー メタリン酸溶液を添加して pHIとなし滴定した．
得た結果を表2および3で示す．
藤井・原田・松田：システィンおよびグノレタチオン（還元型）の分離定量法について 29 
2.0 
，  ． 
1.5 
8 
§ 
:g 
回虫
。凶
0.5 
0.5 1.0 1.5 2.0 
Cysteine soln. (O.lg/dl) ml 
Fig. I. shows the curve of titration value of cysteine using KI03 solution (M/600) 
Table 2. The influence of temperature on the counteraction of cysteine to tetrodotoxin 
Temp. of solution （。C) 0 15 25 35 40 Blank 
Titration value of KI03 (ml) 11.450 11.035 9.201 7.398 0.402 11.463 
Percentage of counteraction 0.2 3. 7 19.3 35.5 96.6 
Table 3. The influence of temperature on the counteraction of glutathione to tetrodotoxin 
Temp. of solution （。C) 0 15 25 35 40 Blank 
Titration value of KI03 (ml) 3. 997 3. 689 3. 438 3. 221 3. 186 4. IOI 
Percentage of counteraction 2.6 10. I 16.2 21. 5 22.3 
上記2表の結果によれば TT－溶液と CySHの反応は低温で、は低いが，温度の上昇と共K反応
も急激に上昇し， 40°CK於ては 96.6~ぢの反応率を示した．それに対し GSH の場合には温度の
上昇l乙伴なう反応率の上昇は非常にゆるやかで 40。Cにおいて22.3%の反応率を示したにすぎな
い．なおこの実験において 40。C以上について検討しなかったのは人体体温（36°C）を目安とし
たためで 40°C以上の場合の CySHの活性については別のテーマのもとに測定をしており，近く
発表の予定である．また反応時聞を一応15分としたため GSHの反応率が高く示された乙とは後
述の反応時間の影響の検討で明らかとなった．
3 2 pHの影響
CySH, GSHの一定量にそれぞれ TT－溶液一定量を加えた後， 乙れに重炭酸ソー 夕、、溶液およ
び酢酸溶液を添加して pHを2～7となし，さらに緩衝溶液を添加し 40。Cで15分間反応させる．
反応後は上述と全く同様に処理滴定し，表4および5を得た．
30 佐賀大学農学業報第23号
Table 4. The influence of pH on the counteraction of cysteine to tetrodotoxin 
pH of reaction 2 3 4 5 6 7 Blank (CySH only) 
Titration value of KI03 (M/ 1200) 9.698 9.064 9.061 9.212 0.414 0.279 13.981 
Percentage of counteraction 30. 7 35.2 35.2 34. I 97. I 98. I 
Table 5. The influence of pH on the counteraction of glutathione to tetrodotoxin 
pH of reaction 2 3 4 5 6 7 Blank (GSH only) 
山 n……的｜ 4, 231 4,033 3,864 3,605 3,452 3,042 4,058 
Percentage of counteraction I. 4 5.5 10.8 15.6 25.6 
表 4,5の結果をみるに， CySHとTT溶液の反応率は pH7で約98$ちを示し， pHがそれよ
り低下すると反応率も低下することが示された．しかし pH2および3の如き低い pHの条件に
おいてもなお357ぢ前後の反応率を示した．これに対し GSHの場合では pH7の条件においても
21. 57ぢの如き低率を示し， pHの低下と共に反応は急激re減少して pH2および3ではほとんど反
応を示さないことが判った．
3-a 反応時閣の影響
反応試料は上述と全く同様にして，反応pHを7，反応温度を40。Cとして反応時聞をそれぞれ
5, 10および15分間とした．実験結果の一例を表6および7で示す．
Table 6. The influence of reaction time on the counteraction of cysteine to tetrodotoxin 
R周 ctiontime (min.) J 5 10 15 Blank (TT only）蜘1k附 Honly)
Titration value of KI03仰 11200>I o. 03s o. 030 o. 025 o. 021 13. 902 
(mt) I 
Table 7. The influence of reaction time on the counteraction of glutathione to tetrodotoxin 
Reacti 凶 min吋＞ I 
Titration value of KI03 (M/1200) I 
(mt) I 
5 
I. 555 
10 
I. 450 
15 Blank (GSH only) 
I. 318 I. 554 
表6および7は次のことを示している．すなわち CySHは5分の反応時間ですでに 98%の反
応率を示すが，乙の聞において GSHはほとんど反応せず， 10分， 15分と時聞がたつにつれてそ
れぞれ6および14.7%という反応率を示すにすぎない．
以上3ー ト3の諸実験結果を総合すると，反応条件として pH7，温度40°C，反応時聞を5分間
としたとき， CySHはTT一溶液とほとんど完全に反応する．これに反して GSHは全く反応しな
いという結果となった．すなわち上述の実験条件によれば CySHとGSHの分離定量をTT一溶液
を使用することにより簡単に行なうととが出来る．
4. CySHとGSHの混合溶液より CySH, GSHの分離定量について
3-1-3の実験結果が正しいのであれば， CySHと GSHの混合溶液からそれぞれを分離定量出
藤井・原田・松田：システィンおよびグノレタチオン（還元型）の分離定量法について 31 
来るわけである．そこで CySHとGSHの一定量を混合してそれに TT一溶液を添加した後に上
述の実件条件で滴定を行ない，別l乙CySH,GSHの一定量をそれぞれ直接に滴定して比較した．
得た実験結果の一例を示す．
Table 8. The selective titration of glutathione from mixture of cysteine and glutathione 
using tetrodotoxin 
Sample Cy SH 
Titration value of KI03 (1¥在／1200)(ml) 0. 705 
GSH 
I. 825 
Mixture (CySH+GSH) 
(Added TT soln.) 
I. 830 
上表の結果は混合溶液中の CySHが TT一溶液と完全に反応したことを示している．すなわち混
合試料溶液l乙対する滴定値は単独試料の GSHの滴定値とほとんど開催であり，TT－溶液は GSH
K対しては何らの影響をあたえていない．すなわち TT溶液を使用することにより， CySHを反
応圏外l乙追い出して， GSHを分離定量出来ることを示している．
要 約
著者等はシスティンが pH7，反応温度 40°C，反応時間5分間という一定条件でテトロドトキ
シンと完全に反応することを発見したので，この事実を利用してシスティン，グノレタチオンの完
全分離を試み，好結果をえた．その方法は次のとおりである．すなわち CySH,GSHの混合溶液
にTT一溶液を添加して CySHを反応圏外lζ追い出して GSHを滴定し，さらに TT－溶液無添加
の場合の滴定数から CySH 滴定値を算出するものである．
なおこの実験は水産大学校において行なったものである．
文献
I.藤井実・原田勝彦・大島寿夫：真空化学 Vol. 12, 221～225 1964 
2.藤井実：日本栄養食糧学会西日本支部大会講演（昭和40年11月於長崎市） 1965 
3.平田義正・後藤俊夫：特許公告No.13647, 1961 
4.奥田譲：九大農学部学芸雑誌 Vol.1, No 2, 1925 （大14)


システィン　オヨビ　グルタチオン　カンゲンガタ　ノ　ブンリ　テイリョウ　ホウ　ニ　ツイテ

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