Hydrolysis of beef tallow by soluble and immobilized lipase from Pseudomonas sp.
in a biphasic organic-aqueous reaction system was investigated. The addition of an
appropriate organic solvent to the reaction system stimulated the hydrolysis of beef
tallow by lipase strongly. Among the organic solvents tested，isooctane was found to be
the most suitable solvent for this purpose. The proportion of isooctane and phosphate
buffer in the reaction mixture was best at the ratio of 1:4. Under this experimental
condition，the reaction rate in a biphasic isooctane-aqueous buffer system was greatly
enhanced compared to that in the organic-solvent-free system，and the percentage of
hydrolysis reached about 40～65%

FUKUZUMI, TAkeshi

OKADA, Fumio

SAKAKIBARA, Mikio

岡田, 文男

榊原, 三樹男

福住, 武司

Hydrolysis of beef tallow by soluble and immobilized lipase from Pseudomonas sp.
	in a biphasic organic-aqueous reaction system was investigated. The addition of an
	appropriate organic solvent to the reaction system stimulated the hydrolysis of beef
	tallow by lipase strongly. Among the organic solvents tested，isooctane was found to be
	the most suitable solvent for this purpose. The proportion of isooctane and phosphate
	buffer in the reaction mixture was best at the ratio of 1:4. Under this experimental
	condition，the reaction rate in a biphasic isooctane-aqueous buffer system was greatly
	enhanced compared to that in the organic-solvent-free system，and the percentage of
	hydrolysis reached about 40～65%

Community Repository of Fukui

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185 
水一有機溶媒二相反応系における牛脂の酵素分解
榊原三樹男事 岡田文男事福住武司事
Enzymatic Hydrolysis of Beef Tallow in a Biphasic 
Organic-Aqueous System 
Mikio SAKAKIBARA， Fumio OKADA， and Takeshi FUKUZUMI 
(Received Aug. 31， 1990) 
Hydrolysis of beef tallow by soluble and immobilized lip笛 e仕omPseudomonas sp. 
in a biph槌 icorganic-aqueous reaction system w槌 investigated. The addition of an 
appropriate organic solvent to七hereact，ion system stimulated the hydrolysis of beef 
主allowby lip出 estrongly. A皿ongぬeorganic solvents tested， isooct組 ew槌 foundto be 
the most suitable釦 lventfor this purpose. The proportion of isooctane組 dphosphate 
buffer in the reaction mixture was best 叫 theratio of 1: 4. Under this experimental 
condition， the reaction rate in a biphasic isooct組 e-aqueousbuffer system w槌 greatly
enhanced comp紅 edto that in the org剖lIc-solvent-frcesystem，組dthe percentage of 
hydrolysis reached abouむ40.，65%.
1.はじめに
油脂の加水分解による脂肪酸とグリセリンの連続的な工業生産法としては、高温・高圧下で行
うCoIgate-Emery法が広く採用されている。しかしながら、この反応プロセスはエネルギー多消費
型のプロセスであるため、常温・常庄で加水分解反応が進行する固定化酵素法が注目を浴び、すで
にかなりの研究が行われているし 2}o ところで、工業的な原料油脂としては牛脂とパーム油がよく
用いられるが、これらの油脂は油脂分解酵素リバーゼの反応至適混度において国体あるいは半国体
状を呈しているo このような固形油脂をそのまま反応系に投入し、固定化リバーゼと反応させても
部分的に固体一国体間接触となるため、分解速度の向上は期待できない。したがって、分散を促進
するための対策が必要と考えられている。
本研究では、適当な非極性有機溶媒を反応系に添加することで固形油脂を液状化し、効率の高い
*生物化学工学科
186 
分解を行わせる手法を確立したのでここに報告するo なお、本研究で用いた酵素の固定化担体とし
ては、食品製造プロセスでの使用を考慮して生体親和性が高い天然高分子からなるキトサン多孔性
ビーズを選択した。
2.実験方法
l) 酵素および活性測定 PseuOl庇 UJ8SSp.起源のリパーゼ粉末(天野製薬製:リバーゼ P)
を使用した。リバーゼ活性単位の測定は、 Yamaneら引によるオリープオイルエマルション法により
行ったo なお、本酵素の活性は36U/mg・powderであったo
2) 基質・試薬 牛脂およびオリープ油は、いずれも油蝋薬品働から購入したo なお、これら
の油脂のケン化価は、牛脂 195、オリープ油 195であったo 有機溶媒その他の薬品は特級品をその
まま使用した。
3) 固定化法 酵素を固定化するまえに、キトサンビーズ[キトパール:IDW-I0I0. BC曹-2510.
BC'-3010.BC'-3510 (富士紡績社製)]を活性化した。すなわち、湿潤状態のキトパール19あたり
に四グルタルアルデヒド溶液 4mlを加え、 30"Cの恒温槽中で 1時間振とうさせグルタルアルデヒド
処理を行った。その後、 lmlあたり 2mgの酵素濃度からなるリパーゼ溶液 (0.11リン酸緩衝液、 pH
7.0) 10ml中に活性化したキトパールを投入し、 20"Cの恒温槽中で 1時間30分振とうさせ、吸着・
架橋反応を行った後固定化リバーゼを得たo なお、酵素タンパク量はLowry法4)で定量した。
4) 牛脂の酵素分解法 反応容器は 4枚の邪魔板付きのセパラプルフラスコに標準槽型 6枚羽
根を取り付けたものを使用した。反応液は0.11リン酸緩萄液 (pH7.0)あるいは緩衝液と有機溶媒
との混合液に、牛脂を全液量に対し20%(w/v)となるように加えて、総量が 200mlになるように調
整した。添加した有機溶媒は、リバーゼ活性の安定化に効果の大きいイソオクタンを選択し、その
割合は20%(v/v)としたち)。酵素濃度は、牛脂19あたりに 25Uとし、それに相当するリバーゼ溶液
10ml (または、遊離酵素活性に相当する固定化リパーゼ量)を反応系に加えた。また、反応温度は
37"Cとしたo
上記の条件下で反応を行うとともに、経時的に反応液 3mlを採取し、これに 1:1ベンゼンーエタ
ノール液12mlを加えて、反応を停止させた後、 500Cの恒温槽中で 5分間振とうすることにより遊離
脂肪酸を抽出した。この抽出液に対しO.INのアルコール性 KOH溶液によるアルカリ滴定を行い、得
られた生成指肪酸量から酸化価を求め、加水分解率を決定した。
3.実験結果および考察
1) キトサンビーズへのリパーゼの固定化 Table 1は各キトサンビーズにリバーゼを固定化
した場合の活性、活性収率および各固定化担体の特徴を示したものである。この表から明らかなよ
うにイオン結合と疎水結合の吸着モードを持つキトパールBCW-3010が最も優れた酵素用担体である
ことが本実験で確かめられた。
2) 担体粒子径の影響 粒子径の異なるキトサンビーズにリバーゼの固定化を行い、それらの
活性を測定した。その結果を示したものが Table 2である。本実験の場合、粒子径の小さい担体
ほど活性および活性収率は高くでるが、これは基質の担体内への内部拡散の影響が現れているため
であると推測される。
Table 1 Immobilization of lipase on various types of chitosan beads 
Support Specific 
(diameter surface area 
1阻)--~-~~-~; 
Pore Adsorbed Specific Activity 
size protein activity yield Activity 
(nm) (昭/g議)(U/昭 -prot.) (施) (U/ g泰)
)(D'-1010 15-100 100-300 0.45 67.3 9. 7 30.3 
BCW-2510 110-130 50-250 0.16 92.5 10.9 14.8 
BCW-3010 120-150 50-250 0.27 170.4 26.2 46.0 
Type of support 
Hydrophile 
Ionic bond mode 
Hydrophobic bond 
187 
and ionic bond mode 
BCW-3510 200-220 50-250 O. 73 
減曹et-weight
3) 固定化リバーゼのpHおよび温度依存性
pH 3.0....9.0の範囲で遊離および固定化
リパーゼの活性測定を行い、その結果を Fig-
ure 1に示した。一般に酵素が固定化される
ことによって、基質に対する作用至適pHが若
干移動することが報告されているが、本実験
の場合、基質に対する至適pHの変化は、いず
れの担体においても認められなかったo これ
らの傾向は小林らの報告ωと似ているo Fig-
ure 2は遊離および固定化リパーゼの活性に
対する温度依存性をpH7.0の条件で調べたも
のであるo 固定化による耐熱性の向上は認め
られなかったが、至適温度が低温側にシフ卜
するという傾向が見られた。とりわけ、キト
パールBCJ-3010に固定化したりパーゼの至適
温度は遊離リバーゼのそれに比べて15tも低
いという興味深い結果が得られた。この間定
化リバーゼは低温域で作用するため、省エネ
ルギー上有用な固定化酵素となり得るであろ
つo
55. 1 8.5 40.2 Hydrophobic bond 
mode 
Table 2 Effects of the size of chitosan 
beads on immobilization of lipase 
Activity 
Support Diameter Activity yield 
(m皿) (U / g梁) (覧)
KDI-1003 0.3 35. 1 9.9 
ー1010 1.0 30.3 9. 7 
-1030 3.0 9.8 5.9 
- -ーー昌平ー苧ーーーーー司--田園・ーーー占・ーー・ー』世直晶ーーー・・ー申『ーー『ーー『ー-
BCW-2503 0.3 23.5 10.6 
-2510 1.0 14.8 10.9 
2ー530 3.0 10.2 7.9 
ーー『ーー---ー『ー司--司ー・・ーー『ーーーー司ー』由甲骨--ーーーーーーーーーーー
BC曹-3003
3010 
3030 
BC曹-3503
-3510 
-3530 
幾曹et-weight
0.3 
1.0 
3.0 
0.3 
1.0 
3.0 
66.9 
46.0 
22.8 
47.4 
40.2 
23.5 
38. 0 
26.2 
12.4 
9. 5 
8. 5 
5.9 
4) 牛脂の酵素加水分解反応に及ぼす有機溶媒の影響 Figure 3は有機溶媒無添加系で牛脂
の酵素分解を検討したものであるo この反応温度 C37t)では、基質である牛脂は固体状を呈して
おり、反応系中の分散という点において非常に不利である。したがって、遊離および固定化リバー
ゼ、いずれの系においても牛脂の分解速度および分解率は変化せず、低い値のままであったo これ
188 
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pH 
-n" o 20 30 40 50 60 
Temperature (・C) 
of soluble and i臨時，bi1izedlipase 
Fi&l Effects of pH on relative activities Fig.2 Effects of t個 peratureon relative 
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包 談話嘉子 主
o 4 8 12 16 20 24 
Reaction time (h) 
Fig.3 Hydrolysis of beef tal10w by 
soluble and iDlDobilized 1ipase in 
an aqueous phosphate buffer system 
activities of soluble and 
immobilized lipase 
100 
4 . 
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o 4 8 12 16 20 24 
Reaction time (h) 
Fig.4 Hydrolysis of beef tallow by 
soluble and immobilized lipase in 
a biphasic is∞ctane-aqu田 us
phosphate buffer system 
o : IDI-I010 '¥ 
口:配下2510l IIIDIObilized lipase ・:Soluble lipase 
o : BCI-3010 I 
ム:1花子3510/ 
に対して、非極性有機溶媒であるイソオクタンを添加した系(有機溶媒:緩衝液=1:4)で牛脂の酵
素分解を行い、有機溶媒の効果を検討したoその結果を示したものが Figure4である。この図か
189 
ら明らかなように、有機祷媒添加系での分解経過は無添加系での反応に比べ、分解速度および分解
率とも高い値が得られた。中でもイオン結合と疎水結合の吸着モードを持つキトパールBC'-3010に
固定化したリバーゼの場合の結果が最も良かった。これは固定化により酵素が安定化されたため遊
離の場合より良い結果が得られたものと推定される。いずれにしても、イソオクタンの添加により
20....3096であった分解率(24h後)が40....6596に向上したことは、酵素一基質問の接触頻度が有機溶
媒によって高められたことを裏付けているo
4.まとめ
遊離および固定化リパーゼ(固定化担体:キトサン多孔性ビーズ)による牛脂の加水分解反応
に非極性有機溶媒(イソオクタン)を添加したところ、有機溶媒無添加系に比べて 2倍程分解率が
向上した。また、この反応系は反応生成物である脂肪酸とグリセリンがそれぞれ有機溶媒相と水相
とに分配されるため、生産物の分離、回収という点においても有利な方法である。
謝辞
キトサン多孔性ビーズ(商品名 キトパール)およびリバーゼ(商品名 リバーゼ P)を供与
していただいた富士紡績および天野製薬株式会社に感謝いたします。
文献
1) S.Negishi， S.Sato， S.lukataka and J. Takahashi， J. Ferment. Bioeng..67. 350(1989) 
2) F.F. 'ang， Y.J.'ang， J.F.Shaw and R.C.Chang， Biotech. Bi関 ng..35. 132(990) 
3) T. Yamane. T.Funada and S.lshida. J. Ferment. Technol.， 60. 517(1982) 
4) H.O.Lowry， N.J.Rosebrough. A.L.Farr and R. J. Randall. J. Biol. Chem..193. 265(1951) 
5) S.lukataka. T.Kobayashi and J. Takahashi. Hakkokogaku.65. 434(1987) 
6) T.Kobayashi. 1.lato. I.Ohmiya and S.Shimizu. Agric. Biol. Chem..44. 413(1980) 
190 


Enzymatic Hydrolysis of Beef Tallow in a Biphasic Organic-Aqueous System

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