Kunitake, Masashi

Sakamoto, Seiko

Sakata, Masayo

Tatenaka Yuki

Todokoro, Masami

クニタケ, マサシ

サカタ, マサヨ

サカモト, セイコ

タテナカ, ユウキ

トドコロ, マサミ

國武, 雅司

坂本, 誓子

坂田, 眞砂代

戸所, 正美

立中, 佑希

Kumamoto University Repository System

熊本大学学術リポジトリ
Kumamoto University Repository System
Title DNA ???????????????????????
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Citation????????????????: 62-63
Issue date2008
Type Journal Article
URL http://hdl.handle.net/2298/9848
Right
１．はじめに
 　遺伝子工学や細胞培養技術の目覚しい進
歩により、細菌を用いた組み換え遺伝子に
よるワクチンの合成や、生物由来抗原およ
び抗体の精製が近年盛んに行なわれてきて
いる。このようにして作られた菌体由来の
タンパク質やワクチン原料中には菌体由来
の核酸(DNA)が普遍的に存在している。微量
残存する DNA は、注射等で体内に投与され
ると転移や突然変異などの生物学的な活性
により、発ガン遺伝子を増殖させる恐れが
あることが WHO から報告されており、これ
らの DNA を除去することが切望されている
(<10 ng/dose) [1]。これらの理由により、
ワクチンや医薬品中から、タンパク質など
の生体に有効な成分を損なう事なく、細菌
由来の DNA を排除することが切望されてい
る。
　我々は既にポリカチオン固定化高分子微
粒子が DNA に対して高い選択性を持つこと
を明らかにしてきた(図 1)。
本研究では、ポリカチオン固定化セルロー
ス粒子に選択的に吸着させた後 DNA の回収
が可能な粒子の開発を目的としている。
２．実験
　ポリカチオン固定化セルロース粒子は、ス
ペーサー(クロロメチルオキシラン)を導入し
たセルロース粒子(Cell)に種々のポリカチオ
ンを化学修飾させることにより調製した。ポ
リカチオンとしては、ポリεリジン(PεL) (チッ
ソ製 ) poly-N,N-dimethylaminopropylacryl-
amide(polyDMAPAA)等を用いた[2]。基体のセ
ルロース粒子としては細孔径(Mlim)の異なる 2
種類を用いた(CPC-m (Mlim106)、GC-15 (Mlim 103))
(図 2、表 1)。
各粒子を樹脂製のカラム(9mmφ×50mm)に充填
し、生体環境に近い実験条件(pH 7.0、µ=0.2)
で、タンパク質混合溶液から DNA の選択分離
を試みた。ポリカチオン架橋粒子の調製は、
既存の懸濁蒸発法を用いて、DMAPAA/DVB=9/1
架橋粒子を調製した[3]。タンパク質の濃度
は UV 法、DNA 濃度は DAPI を用いた蛍光法に
より定量した。
DNA のクロマト分離のための
ポリカチオン固定化セルロース粒子の設計と応用
○坂本 誓子, 立中 佑希, 坂田 眞砂代,
國武 雅司（熊本大学大学院自然科学研究科）戸所 正美（チッソ）
ー
ー
ー
ー
アデニン
グアニン
チミン
シトシン
疎水部
親水部
ポリカチオン固定化
セルロース粒子
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋＋
＋
静電的相互作用
DNA
吸着剤
図1　DNAの吸着機構
poly(ε - lysine)
O
n
O
OH
OHCH2
OH
Cellulose
O-CH2-CH-CH2
OH
n
=
 NH-CH 
(CH2)4
OC
NH
n = 35
図2 ポリカチオン固定化粒子の化学構造
AEC pore size
(meq / ml) Mlim
PεL-Cell(S) 0.32 1×103
PεL-Cell(L) 0.36 3×105
DMAPAA/DVB 4.42 2×103
表1 各粒子の粒子特性
３．結果と考察
　図 3 に PεL-Cell(S)カラムを用いた DNA 選
択吸着回収実験の結果を示した。イオン強
度µ=0.2、pH7.0 の条件下で DNA/BSA 混合溶
液を同カラムに通液すると、DNA はカラムに
選択吸着され、BSA のみが溶出された。その
後、同カラムをリン酸 buffer で洗浄した後、
0.2M から 3M までの NaCl 溶液を同カラムに
グラジェントに通液させることにより DNA
のみを回収することができた。
表 2 には DNA 溶出 buffer として 2M NaCl を
用いた時の、種々のポリカチオン粒子の DNA
選択吸着及び脱離特性を示した。PεL-Cell
粒子の DNA の選択吸着率は、DMAPAA 架橋体
と比べると高かった。一方、PεL-Cell 粒子
の DNA 回収率は、DMAPAA 架橋体に比べて低
かった。DNAとPεL-Cellの相互作用は、DMAPAA
架橋体との相互作用よりも強いので、吸着
した DNA はほとんど溶出しなかったものと
考えられる。一方、DMAPAA 架橋体は DNA と
の相互作用が弱いために、DNA の回収率は高
くなったと考えられる。よって、DNA を選択
的に吸着させ、かつ溶液条件を変えること
により DNA を回収するためには、ポリカチ
オンと DNA の相互作用が適度に弱い粒子設
計が必要となることがわかった。
４．参考文献
[1] Report on the WHO Expert Committee on
Biological Standardization, WHO Weekly
Epidemiological, 72, 141-145 (1997).
[2] M. Sakata, M. Nakayama, K. Yanagi, M.
Sasaki, M. Kunitake, C. Hirayama, J. Liq.
Chrom. & Rel. Technol., 29 , 2449-2512
(2006).
[3] M. Sakata, M. Nakayama, T. Kamada, M.
Kunitake,C. Hirayama, J. Chromatogr. A. 1030,
117-122(2004).
<謝辞>本研究は新エネルギー･産業技術総合
開発機構 (NEDO)の平成 15 年度産業技術研
究助成により実施された。
[問い合せ先]
坂田　眞砂代
熊本大学大学院自然科学研究科
TEL 096-342-3674
E-mail  msakata@gpo.kumamoto-u.ac.jp
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0
200
400
600
800
1000
1200
0 100 200 300 400
溶出液(ml)
BSA回収率
100%
DNA回収率
13%
DNA/BSA
溶液
↓
0.02M
リン酸
buffer
↓ ↓NaCl 溶液 PεL-Cell(S)
BSA
NaCl
DNA
DNA選択吸着
DNA脱離
DN
Aの
濃
度
( µ
g/m
l) 
(○
)
Na
Cl
の
濃
度
(m
ol/
l) 
 (□
) BSA
の
濃
度
(µ g/ml) ( ■
)
全BSA回収率
DNA吸着(%) BSA吸着(%) DNA回収(%) BSA回収(%) (%)
PεL-Cell(S) >99 8 5 7 99
PεL-Cell(L) >99 8 8 7.5 99
DMAPAA/DVB 97 <1 34 <1 100
DNA吸着buffer
(0.02M PBS buffer (pH 7.0, µ=0.2))
DNA溶出buffer
(2M NaCl溶液)
図4 DNAとタンパク質の吸着挙動の違い
図3   DNA吸着回収実験におけるDNAとBSAの溶出挙動
　　 カラムサイズ:0.9×5 cm(I.D.) (3.18 ml)
         流速:0.1 ml/min
         Buffer:0.02M-リン酸buffer, pH 7.0, µ=0.2
         Sample:60 ml(BSA:1000 µg/ml, DNA:10 µg/ml)　　　
表2 各粒子のDNA/BSA溶液からのDNAおよびBSAの回収


DNA ノ クロマト ブンリ ノ タメ ノ ポリカチオン コテイカ セルロース リュウシ ノ セッケイ ト オウヨウ

http://reposit.lib.kumamoto-u.ac.jp/bitstream/2298/9848/2/5.3.2.pdf

DNA ノクロマトブンリノタメノポリカチオンコテイカセルロースリュウシノセッケイトオウヨウ

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