Protein und Farbstoffe in begrenzter Geometrie und Protein-Dynamik: Untersuchungen mit Fluoreszenz-Verfahren und NMR-Spektroskopie

Abstract

Mesoporöse Materialien mit geordneter Porenstruktur sind von Interesse im Hinblick auf ihr breites Anwendungspotenzial in verschiedenen Feldern, unter anderem als Träger von Wirkstoffen oder künstlichen Licht-Antennen, sowie in der Biokatalyse. MCM-41 Silica-Nanoteilchen mit definierter Porenweite im Bereich von 3 bis 4 nm weisen vielversprechende Eigenschaften als Trägerpartikel für pharmazeutische Wirkstoffe auf, doch bleibt die Entwicklung eines einfachen und bio-kompatiblen Porenverschluss-Systems eine Herausforderung. Wir haben gefunden, dass Lysozym-Moleküle als pH-responsive Nanoschalter zum Verschließen und Öffnen der Poreneingänge von MCM-41 Teilchen wirken können. Experimente mit dem Farbstoff Rhodamin B als Modell-Wirkstoff zeigen, dass die Wirkung von Lysozym als molekularer Schalter auf einer pH-induzierten Konformationsänderung beruht, durch welche die effektive Größe der Proteinmoleküle in reversibler Weise beeinflusst wird. Dieser Effekt könnte die Basis für Systeme zur kontrollierten Wirkstoff-Abgabe ohne Notwendigkeit einer chemischen Modifizierung der Porenwände oder des Porenverschlusses bilden. Mesoporöse Silica-Materialien sind auch von Interesse als Wirtsmaterialien zum Studium photochemischer Prozesse in räumlich begrenzter Geometrie. Es wurde der Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer (FRET) von Fluorescein (Donor) auf Rhodamin B (Akzeptor) in MCM-41 Silica mittels der Fluoreszenz-Lebenszeit-Imaging-Mikroskopie (FLIM) studiert. Messungen für eine konstante Donorkonzentration und verschiedene Akzeptor-Konzentrationen wurden mittels multi-exponentiellen Abfall-Funktionen analysiert. Aus den FRET-Daten wurde der Donor-Akzeptor Abstand rDA ermittelt und mit dem aus der (Gesamt-) Farbstoff-Konzentrationen bestimmten mittleren Teilchenabstand d verglichen. Bei hohen Farbstoff-Konzentrationen ergeben sich für rDA Werte ähnlich zu d, bei geringen Farbstoff-Konzentrationen dagegen deutlich kleiner als d. Hieraus lassen sich Rückschlüsse auf die Verteilung der Moleküle in der porösen Matrix ziehen. Diese Untersuchungen bilden eine Basis für weiterführende Untersuchungen zum Studium der Verteilung von Proteinmolekülen in den Poren von geordnet mesoporösen Silica-Materialien. Obwohl das aktuelle Verständnis von Enzym-Funktion überwiegend auf der aus der Röntgen-Strukturbestimmung erhaltenen statischen Proteinstruktur basiert, wird allgemein vermutet, dass auch die Protein-Dynamik von essentieller Bedeutung für ihre biologische Funktion ist. Dehaloperoxidase-Hämoglobin (DHP A) kann halogenierte Aromaten oxidativ dehalogenieren unter Beibehaltung ihrer Sauerstoff-Speicherfunktion. In dieser Arbeit wurden heteronukleare NMR Methoden benutzt, um die Dynamik von DHP A in Lösung in Gegenwart des Substrats 2, 4, 6-trichlorophenol (TCP) zu studieren. Für die NMR Messungen wurde mit 15N angereichertes DHP A hergestellt. Die NMR Relaxationsparameter T1 und T2 und {1H}-15N NOE wurden mittels reduced spectral density mapping und der Lipari-Szabo modellfreien Methode analysiert. Die in dieser Arbeit gewonnenen 15N-Relaxationsdaten geben Hinweise auf langsam ablaufende Konformationsänderungen in DHP A in Gegenwart von TCP. Weitere Unter-suchungen sind nötig, um diese Ergebnisse abzusichern und ihren Bezug zur katalytischen Oxidation abzuklären.There has been ever increasing interest in ordered mesoporous materials because of their high applications potential in many fields, such as drug delivery, artificial light-harvesting and biocatalysis. MCM-41 mesoporous silica nanoparticles with pore widths in the 3 to 4 nm range hold great promise as a drug carrier vehicle because of the chemical stability, well-defined pore geometry, and tunable pore size of the particles, but the development of simple and biocompatible capping system for the pores has remained a challenge. We have found that lysozyme molecules can act as a pH-responsive nano-valve to block and unlock the pore entrances of MCM-41 nanoparticles for guest molecules. Experiments with the dye rhodamine B as a model drug indicate that pore blocking by lysozyme is due to a pH induced conformational change by which the effective size of the protein is changed in a reversible manner. This effect may form the basis of a controlled-release system without the need to functionalize the pore mouth and caps. Mesoporous silica materials have also attracted interest as a host for nano-confined dye molecules, which undergo enhanced energy transfer and exhibit optical functionality. Measurements of the fluorescence resonance energy transfer (FRET) from fluorescein (donor) to rhodamine b (acceptor) molecules embedded in the pore space of MCM-41 silica were performed by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) and are analyzed in terms of a two- and three-exponential decay function. Results are presented for a given donor concentration and a wide range of acceptor concentrations. The mean donor-to-acceptor distance rDA as calculated from the FRET efficiency is compared with the mean separation of dye molecules d as obtained from the measured uptake. It is found that rDA is similar to d at high overall dye concentrations but significantly smaller than d at low concentrations. These findings are discussed in terms of the distribution of molecular distances of the guest molecules in the silica matrix. These FRET studies with dye molecules form a basis for an investigation into the mean distance between protein molecules in the pore space of ordered mesoporous silica materials. Although current understanding of enzyme function is based mostly on static protein structures as obtained from X-ray crystallography, the dynamics of protein molecules is believed to be essential to their biological function. Dehaloperoxidase-hemoglobin (DHP A) can oxidatively dehalogenate haloaromatic compounds while maintaining its oxygen storage function. We have used hetero-nuclear NMR methods to probe the dynamics of DHP A in solution in the presence of the substrate 2, 4, 6-trichlorophenol (TCP). To facilitate the NMR measurements, DHP A was labeled with 15N, and NMR relaxation parameters T1 and T2 and {1H}-15N NOE have been analyzed using reduced spectral density mapping and the Lipari-Szabo model free method. The preliminary 15N spin-relaxation data reveal evidence for the presence of slow conformational exchange in DHP A in the presence of TCP. Further work is needed to corroborate these findings and their significance for the catalytic oxidization reaction