Development and investigation of an absorbable scaffold for the treatment of articular cartilage defects

Abstract

Aufgrund der unzureichenden regenerativen Fähigkeiten des Gelenkknorpels führen bereits kleine Läsionen zu progressiven Gelenkbeschwerden, die in einer Arthrose und nachfolgender Invalidität enden können. Bedingt ist diese Problematik durch die spezielle Anatomie des Knorpelgewebes, insbesondere durch seine Avaskularität. Da die bisher eingesetzten konventionellen Behandlungsmethoden bei der Regeneration von zonal aufgebautem, hyalinem Knorpel scheitern, werden seit etwa 20 Jahren neue, regenerative Therapien erforscht. Den Startpunkt dieser Methoden bildete 1994 die von Brittberg beschriebene autologe Chondrozyten-Transplantation (ACT), bei der körpereigene Knorpelzellen für die Reparatur des Defekts genutzt werden. Aufgrund von operationstechnischen und zellbiologischen Problemen wurde diese Methode zu trägerassoziierten Verfahren weiterentwickelt, bei denen resorbierbare Zellträger für eine dreidimensionalen Anordnung der Chondrozyten und des sich bildenden Gewebes sorgen. Das Trägermaterial muss dabei verschiedene Anforderungen bezüglich der Biokompatibilität, der Struktur, der chemischen und mechanischen Stabilität sowie der Oberflächeneigenschaften erfüllen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte ein Zellträgermaterial, basierend auf Gelatine und dem synthetischen Polymer PLGA, hergestellt werden, das die Anforderungen an ein Trägermaterial möglichst weitgehend erfüllt. Durch die anfängliche Rezepturoptimierung gelang es dabei, das PLGA lösemittelfrei und homogen in der Gelatinebasis zu integrieren. Anschließend erfolgte die Herstellung der schwammförmigen Zellträger mittels gerichtetem Einfrieren und Gefriertrocknung, wobei durch Anpassung der Herstellungsparameter eine gleichmäßige und parallel angeordnete, durchgängige Porenstruktur erzeugt werden konnte. Die nachfolgende Vernetzung und Sterilisation des Materials gelang in einem einzigen Prozessschritt durch eine dehydrothermale Behandlung. Anhand der folgenden physikochemischen Charakterisierung der entstandenen Gelatine-PLGA-Scaffolds konnte eine optimale Porosität und Porengröße für die Besiedelung der Zellträger festgestellt werden. Weiterhin zeigte die Untersuchung zur in vitro Degradation des Materials bei konstantem physiologischen pH-Wert und der Abwesenheit von spezifischen Enzymen eine gute chemische Stabilität der Scaffolds. Mit Hilfe von in vitro Zytotoxizitäts-Versuchen sowie einer in vivo Studie zur Gewebeverträglichkeit gemäß DIN EN ISO 10993 wurde außerdem eine gute Biokompatibilität des Materials festgestellt. Zusätzlich waren an den histologischen Präparaten der in vivo Studie eine bessere Gewebeintegration und eine geringere Fremdkörperreaktion, verglichen mit dem bereits zugelassenen Kontrollmaterial Ethisorb®, feststellbar. Bei weiterführenden in vitro Versuchen zur Besiedelbarkeit der Zellträger mit primären Chondrozyten konnte durch eine dynamische Besiedelungsmethode und Optimierung der Zelldichte eine gleichmäßige Zellverteilung auf und in dem Scaffold-Material erreicht werden. Immunhistologische Untersuchungen bezüglich des Gehalts an Kollagen II in der synthetisierten Matrix zeigten dabei, dass der differenzierte Status der Chondrozyten erhalten blieb. Eine erste Funktionalitätsstudie am Gelenkknorpeldefekt von Ziegen deutete zudem im Vergleich zur bisherigen operativen Standardmethode Mikrofrakturierung auf eine bessere Geweberegeneration des Defekts nach Mikrofrakturierung mit anschließender Applikation des Trägermaterials (AMIC-Verfahren) hin. Der entwickelte Gelatine-PLGA-Scaffold stellt demnach aufgrund der untersuchten Eigenschaften und insbesondere seiner optimalen Struktur einen geeigneten Zellträger zur Unterstützung der Knorpelregeneration dar.Since articular cartilage has only insufficient regenerative properties, even small lesions lead to pro-gressive joint complains, which can end up in osteoarthritis and subsequent disability. This problem is caused by the special anatomy of cartilage tissue, in particular its avascularity. Because previously used conventional treatments fail in the regeneration of zonal hyaline cartilage, new regenerative therapies are being researched for approximately 20 years. The starting point of these methods was described in 1994 by Brittberg as the autologous chondrocyte transplantation (ACT), which uses endogenous cells for the repair of cartilage defects. Because of its technical and cell biological prob-lems, this method was further developed to carrier-associated techniques, which utilize absorbable scaffolds for a 3D arrangement of chondrocytes and the newly formed tissue. Hence, the scaffold material has to meet different requirements regarding the biocompatibility, the structure, the chemical and mechanical stability as well as appropriate surface properties. The purpose of this thesis was to develop and characterize a scaffold, based on gelatine and the synthetic polymer PLGA, which should largely fulfill the requirements for cell-carriers. The initial optimization of the formulation led to a solvent-free and homogenous integration of the PLGA into the gelatine base. The porous gelatine-PLGA scaffolds were subsequently fabricated using a unidirectional freeze drying method. Thereby, it was possible to generate a consistent pore structure with continuous and parallel oriented pore channels by modulating the production parameters. The following crosslinking also successfully sterilized the material in a single process using a dehydrothermal treatment. The morphological characterization of the generated constructs revealed optimal porosity as well as pore size, indicating a good applicability for culturing the scaffolds with chondrocytes. Furthermore, the analysis of the in vitro degradation showed that the scaffolds are chemically very stable at physiological pH values and the absence of specific enzymes. With the help of in vitro cytotoxicity assays and an in vivo study regarding tissue compatibility, which were performed according to DIN EN ISO 10993, a good biocompatibility of the material was determined. Additionally, the histological preparations of the in vivo study revealed improved tissue integration and a lower foreign body reaction compared to the already licensed control material Ethisorb®. Further in vitro experiments regarding the seeding of the gelatine-PLGA scaffolds with primary chondrocytes showed that a dynamic seeding-method combined with an optimal cell density led to a homogenous cell distribution on the scaffold surface as well as within the constructs. Immunhistochemical analysis of collagen type II revealed the secretion of cartilaginous extracellular matrix, indicating the maintenance of the differentiated chondrocyte status. Besides that, a first study of functionality in cartilage defects of goats pointed to a better tissue regeneration after application of microdrilling and scaffold (AMIC method) compared to microdrilling alone, which is the actual conventional standard method. In summary, due to its properties and especially its optimal structure the gelatine-PLGA scaffold represents an appropriate cell-carrier for supporting the cartilage regeneration