筑波大学博士 (医学) 学位論文・平成24年3月23日授与 (甲第6240号

加藤 貴康

筑波大学University of Tsukuba博士（医学）Doctor of Philosophy in Medical Sciences2011【要旨】thesi

加藤, 貴康

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Tsukuba Repository  (Tulips-R)

転写因子Hes1による急性骨髄性白血病の発症抑制現象の発見とその分子機構の解析著者 加藤 貴康内容記述 筑波大学博士 (医学) 学位論文・平成24年3月23日授与 (甲第6240号)発行年 2012URL http://hdl.handle.net/2241/117787氏名(本籍)学位の種類学位記番号学位授与年月日学位授与の要件審査研究科学位論文題目????[365] か とう たか やす加藤貴康(新潟県)博士(医学)博甲第 6240 号平成 24年3月23臼学位規則第4条第 1項該当人間総合科学研究科転写因子 Hes1による急性骨麓性白血病の発症抑制現象の発見とその分子機構の解析一????筑波大学教授筑波大学教授筑波大学講師筑波大学講師産学博士涯学博士博士(理学)博士(医学)????????????論文の内容の要旨(目的)転写因子hairyenhancer of split1 (Hes1)は様々な組織において幹細胞の維持や細胞分化抑制能を持つことが広く知られている。一方で、慢性骨髄性白血病においては、 Hes1の過剰発現が骨髄球を不死化させ、白血病発症を促進するとの報告があるが、同時に、 Hes1の上流シグナルと位置付けられる Notchシグナルは骨髄性腫蕩に対して1重傷抑制的に働くという報告もある。本論文においては、 Hes1ノックアウトマウスを用いて造血幹細胞や前駆細胞の機能を明らかにすることを目的とした。また、 Hes1ノックアウトマウスを用いて MLL-AF9遺伝子導入によるマウス急性骨髄性白血病モデルを作製することにより、骨髄性白血病幹細胞が維持されるメカニズムを明らかにすることを目的として研究を行った。(対象と方法)マウス胎生 14.5日の百es1-/・およびHes1+/+胎仔肝から造血幹細胞分画を含む cKit+Sca1+Lineage帽分画(KSL)をFACSAriaでソートしコロニー形成能を比較した。次にHes1・/ーおよび、Hes1+/+胎仔肝(Ly5.2)を9.5Gyの放射線照射マウスに競合細胞 (Ly5.l)と併せて移植し、移植後の末梢血でLy5.2陽性細胞と Ly5.l陽性縮胞のキメリズムを比較することにより、 Hes1により造血幹細胞の骨髄再構築能につき検討した。次にHes1 +/+およびHes1・/-胎仔肝より分離した共通骨髄前駆細胞 (CMP) に、白血病融合遺伝子である Mixed-lineage leukemia (MLL) -AF9を遺伝子導入し、不死化した乱仏L-AF9導入CMP細胞を 4.5Gyもしくは 9.5Gyの放射線照射マウスに移植し、 Hes1の白車病発症における影響について検討した。また MLL-AF9導入CMP細胞に関しては、百es1-/・細胞と Hes1+/+細胞についてコロニー形成能、細胞表面抗原、細胞周期、アポトーシス、乱1LL白虫病に関連するmRNAの発現レベルについて比較検討をおこなった。さらに乱1LL-AF9導入Hes1+/+CMP細胞に dominantnegative Hes1 (d叶-Ies1) を導入し、不死化した細胞を同様にマウスへ移植し、白血病発症の有無につき検討した。 併せてコロニー形成能、表面抗原、細胞周期、アポトーシスにつき解析した。(結果)Hes1-/・およびHes1+/+KSL細胞のコロニー解析では、 2回目以降の継代にて百es1・/・群のコロニー数が有意818 に減少していた。 Hes1+/+およびHes1+/+胎仔肝細胞を用いて 3自のマウス継代移植をおこなったo Hes1-1-マウス群はT細胞キメリズムが有意に低下していたが、総キメリズムについてはコントロール群と有意差がみられなかった。MLL-AF9導入Hes1-1・CMPはHes1+I+CMPと同様に3回以上のコロニー継代が可能であり、コロニー数も Hes1-/ー 群が多い傾向にあった。細胞株化した両群において細胞表面抗原、細胞周期、アポトーシスに関して有意差を認めなかった。 MLL-AF9 導入 Hes1-/-CMP を移植したマウスは移植後 4~6 週後に75%が白血病を発症し、 62%が死亡した。また d叶-Ies1/MLL-AF9導入CMPのコロニー形成能は、 mocklMLしAF9導入CMP細胞と同等であった。細胞表面抗原、細胞周期やアポトーシスに有意差を認めなかった。dnHesl!MLL-AF9導入 CMP移植マウスは 6退から 10週にかけて全マウスが白血病を発症し死亡したが、mockll¥1LL-AF9導入CMP移植マウスは 12~ 18週で70%が自血病を発症し死亡した。白血病を発症したdnHes 1/MLL-AF9導入C乱1p移植マウス骨髄を採取し 2次移植を行ったが、 2次移植マウスは 4週以内に白血病を発症して死亡したo MLL自血病に関連する mRNAの発現レベルは、細胞株化した MLL-AF9導入CMPにおいて、 Meis1の発現がHes1・/ー群でHes1+/+群と比較し有意に上昇していた。 HoxA9の発現レベルは伺群で有意差を認めなかった。(考察)Hes1は分裂期に戻ることのできる可逆的な静止期を長期に渡って維持するために必要であることが示されており、 Hes1が造血幹細胞をはじめとする各種幹細胞の維持や分化に与える作用に注目が集まりつつある。 Hes1-/岨胎仔肝を用い 3回の継代移植を行ったが、 Hes1は造血幹細胞の維持や自己複製能に影響を与えなかった。今回の実験により、 Hes1ノックアウトマウス胎仔肝においても、 Heslは造血幹細胞における自己複製や維持に必須ではないことが示されたりこれまでの Notchシグナルと T細胞性白血病などの造車器麗傷に関連する報告から、 Hes1が白血病幹細胞の発症や維持に必須であると予想された。しかし、 Heslの欠損により白血病が早期に発症した本研究の結果から、 MLL-AF9急性骨髄性白血病において、 Hes1が腫蕩抑制因子として作用していると考えられる。2011年になり、造血器腫蕩である慢性骨髄単球性白血病において Notchシグナルが騒場抑制因子として働いているとの報告がなされたo Hes1は、白血病幹細胞の分化段階や細抱系統の違いによって、癌遺伝子として機能する場合と腫蕩抑制因子として機能する場合があることが示唆された。審査の結果の要旨本研究から、胎仔肝由来の造血幹細胞の維持に Hes1は必須ではないことが明らかになった。また Hes1は、Meis1の発現を抑えることで孔1LL-AF9急性骨髄性白血病に対して腫蕩抑制的に働くことが示された。本論文は、 Heslの機能の二面性を示したものとして、高く評価される。平成 23年 12月22日、学位論文審査委員会において、審査委員全員出席のもと論文について説明を求め、関連事項について質疑応答を行い、最終試験を行った。その結果、審査委員全員が合格と判定した。よって、著者は博士(医学)の学位を受けるに十分な資格を有するものと認める。819 

転写因子Hes1による急性骨髄性白血病の発症抑制現象の発見とその分子機構の解析

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テンシャインシ Hes1 ニヨルキュウセイコツズイセイハッケツビョウノハッショウヨクセイゲンショウノハッケントソノブンシキコウノカイセキ

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