Thesis (Ph. D. in Science)--University of Tsukuba, (A), no. 5714, 2011.3.25Includes bibliographical references (leaves 45-53

小林 万希子

筑波大学University of Tsukuba博士（理学）Doctor of Philosophy in Science2010【要旨】thesi

小林, 万希子

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Tsukuba Repository  (Tulips-R)

Studies for generation of mitochondrialdisease model mice by introduction of mtDNAfrom different rodent species著者 小林 万希子内容記述 Thesis (Ph. D. in Science)--University ofTsukuba, (A), no. 5714, 2011.3.25Includes bibliographical references (leaves45-53)発行年 2011URL http://hdl.handle.net/2241/114603[193] (;1'やし まき小林万希子(茨城県)博士(理学)博甲第 5714 号平成 23年3月25日学位規則第4条第 1項、該当生命環境科学研究科氏名(本籍)学位の種類学位記番号学位授与年月日学位授与の要件審査研究科学位論文題百????Studies for Generation of Mitochondrial Disease Model Mice by Introduction of mtDNA from Different Rodent Species (異種 mtDNAの導入によるミトコンドリア病モデルマウスの作製に関する研究)????理学博士理学博士博士(理学)理学博士林純漆原秀子中田和人沼田 治筑波大学教授筑波大学教授筑波大学准教授筑波大学教授論文の内容の要旨ミトコンドリア独自のゲノムであるミトコンドリア DNA(mtDNA)には 13種の呼吸酵素複合体サブユニット遺伝子、 2種の rRNA遺伝子、 22穫の tRNA遺伝子が存在し、その複製、転写、翻訳は核 DNA由来の因子によって制御されている。また、呼吸酵素複合体は核DNA由来のサフ、、ユニットと mtDNA由来のサブユニットの両方が集合し機能している。つまり、 ミトコンドリアは核と mtDNAの二重支配を受けている。mtDNAに突然変異が生じミトコンドリア機能異常が起こると、ミトコンドリア病(ミトコンドリア脳筋症)を発症することが知られている。しかし実際には mtDNAの突然変異とミトコンドリア病との関係は状況証拠しかなく、ミトコンドリア病の発症機構および治療方法を解明するためには mtDNAに変異をもっミトコンドリア病モデルマウスが必要である。ところが、核 DNAとは異なり mtDNAの遺伝子操作は技術的に未確立であるため、 ミトコンドリア病モデルマウスを作製するためには mtDNA体細胞突然変異を利用する方法と異撞 mtDNAを利用する方法しかなし」本研究では、後者の異種 mtDNAを利用したミトコンドリア病モデルマウスの作製を試みた。まず、どの穫の mtDNAを用いるかを調べるために、以下のような実験を行った。一般的実験用マウス (Musmusculus)の核をもち、同じ Mus属で種の異なる Mus.stretusおよび属の異なるラット (Ratlusnorvesicus) の mtDNAをもっサイブリッド(それぞれ CyMs，CyRn) を作製した。すると、 CyMsは、マウス (Mus.musculus)の mtDNAをもっサイブリッド (CyMm) と間程度の呼吸活性を示した。一方 CyRnは、 CyMmの20・50%の呼吸活性しか示さなかった。また、さらに遺伝学的に遠い種であるハムスターの mtDNAはマウスの核支配下では安定して存在できないことを確認した。以上のことより、ミトコンドリア病モデルマウスの作製には呼吸活性の低下を引き起こすラット mtDNAを利用することが最適であることが分かった。ラット mtDNAをもっマウスの作製には、ラット mtDNAをマウス初期妊に導入する方法と、マウス ES細胞に導入する方法が考えられる。しかし、マウス初期妊にもマウス ES細胞にもマウス自身の mtDNAが多数存在しており、出生僧体に導入したラット mtDNAが存在できるのかは疑問である。そこで、次のような440 実験を行った。上記で作製したマウス核とラット mtDNAをもっサイブリッド CyRnにマウスの塩小板を融合させマウス mtDNAを導入した。するとラット mtDNAはマウス mtDNAに完全に置き換わってしまった。つまり、マウス核支配下ではマウス mtDNAが優先的に複製され、ラット mtDNAは拐対的に排除されてしまうと考えられる。このことから、ラット mtDNAをもっモデルマウスを作製する場合には、ラット mtDNAを導入する初期佐または ES細胞のマウス mtDNAを完全に排除しておく必要があることが分かつたOこれらの結果に基づき、ラット mtDNAをもっモデルマウスの作製手JIE{として以下を提案した。① mtDNAを持たないマウス ES細胞を作製する (ES細胞の mtDNAはローダミン 6G処理により除去されるとし寸報告がある)。②①で作製した ES細砲にラット mtDNAを導入し、ラット mtDNAとマウス核をもっ ES細胞を作製する。① マウス 8細胞期佐に②で作製した ES細胞を導入し、キメラマウスを作製する。④ キメラマウスの交配を重ね、全身にラット mtDNAをもっマウスを作製する。この研究の後、笠原等は、上記②のラット mtDNAを持つマウス ES細胞の作製に成功した。そしてキメラマウスの作製が試みられたが、ラット mtDNAによる呼吸機能の低下が重篤であったためかキメラマウスは得ることカfできなかった (Hum.Mol. Genet.， 15(6):871-81)。このことより、ラット mtDNAをもっミトコンドリア病モデルマウスの作製は不可能であると考えられる。したがって、遺伝的距離がMusmusclωに対し Muss戸retusとラットの間にある種が適切である。 McKenzie等は、 MuscaroliのmtDNAをもっサイブリッドを作製したが、 .Musstretus同様、サイブリッドの呼吸機能低下は認められなかった。 .Muscaroliよりさらに遺伝的に遠い種としては、 A戸odemus(アカネズミ属)やおkudaia(トゲネズミ属)があり、これらがモデルマウス作成のための mtDNA供与種となる可能性が残されている。審査の結果の要旨本論文は、異種mtDNAの導入によるミトコンドリア病モデルマウスの作製について、最新の知晃も合わせてまとめられている。著者は、核 DNAとmtDNAとが異援のものであるサイブリッドを作製し、そのmtDNAの複製、転写、翻訳活性および呼吸活性を測定した。この結果より、異種mtDNAを用いたミトコンドリア病モデルマウス作製にはラット mtDNAの利用が適していることを見出した。本研究は、 mtDNAの遺伝子操作が不可能である現状においてミトコンドリア病の作製方法を提唱した点、およびmtDNAと核DNAの相互作用に対する新たな考察を得ることができた点において学問的価値が高いと判断できる。よって、著者は博士(理学)の学位を受けるに十分な資格を有するものと認める。441 

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