OHNEDA OSAMU

大根田 修

Tsukuba Repository

虚血性疾患治療に効果的な血管内皮前駆細胞の機能
解析
著者 大根田 修
発行年 2011
その他のタイトル Analysis of functional EPC for the treatment
of ischemic disease
URL http://hdl.handle.net/2241/115018
 
様式 C-19 
科学研究費補助金研究成果報告書 
平成 23 年４月１日現在 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
研究成果の概要（和文）：生体内で機能的に働くアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性の低い血管内
皮前駆細胞（ALDH-Low EPC）は，低酸素応答性を有していることから，低酸素応答転写因子(HIF)
の役割について解析を行った．HIF-2alpha が ALDH-Low EPC の創傷治癒に作用していることが，
有茎皮弁マウスモデルの解析で明となった。また，HIF の標的遺伝子である VEGF および CXCR4
が創傷治癒に重要な役割を果たしていることが証明された。 
 
研究成果の概要（英文）：We have reported previously that ALDH-Low EPC possess hypoxic 
response. In this study, we examined how hypoxia-inducible factor (HIF) is involved in 
the repair of ischemic tissue in a mouse flap model. HIF-2alpha but not HIF-1alpha was 
highly associated with the reduced tissue damage in ischemia. Finally, we found that 
HIF-target genes, VEGF and CXCR4, have an important role for the neovascularization in 
ischemic tissue. 
 
交付決定額 
                               （金額単位：円） 
 直接経費 間接経費 合 計 
2008 年度 1,400,000 420,000 1,820,000 
2009 年度 1,400,000 420,000 1,820,000 
2010 年度 700,000 210,000 910,000 
年度  
  年度  
総 計 3,500,000 1,050,000 4,550,000 
 
研究分野：再生医学 
科研費の分科・細目：内科系臨床医学・循環器内科学 
キーワード：再生医学，循環器・高血圧，移植・再生医療．細胞・組織 
 
１．研究開始当初の背景 
 血管内皮前駆細胞(EPC)は，生体内では虚
血・炎症の際に，主に骨髄から末梢血中に
移動し，新生血管の構築に寄与すると考え
られている．骨髄以外の組織では，脂肪組
織や臍帯血に EPC が存在していることが報
告されている．最近 Yoder らのグループに
よって，ヒト成体由来血管内皮細胞株にお
いても EPC 様の増殖能を持つ細胞の存在が
明 ら か に さ れ た (Blood 2005; 106: 
1524-1531)．このことは，既存の血管を構
成している血管内皮細胞において，EPC 様
の性質を有する細胞が存在し，虚血・炎症
の際に生じる新生血管の一部を構成する内
皮細胞として作用する可能性を強く示唆す
るものである． 
機関番号：12102 
研究種目：基盤研究(C) 
研究期間：2008～20010 
課題番号：20590876 
研究課題名（和文）虚血性疾患治療に効果的な血管内皮前駆細胞の機能解析 
 
研究課題名（英文）Analysis of functional EPC for the treatment of ischemic disease 
 
研究代表者 
大根田 修（OHNEDA OSAMU） 
  筑波大学・大学院人間総合科学研究科・教授 
   研究者番号：30311872 
 骨髄から EPC の末梢血中への動員は，
G-SCF (granulocyte colony-stimulating 
actor) あ る い は AMD3100 (CXCR4 
antagonist) によって誘導されることが報
告されている．末梢血中の EPC の単離は，
主にCD45陰性/CD34陽性細胞を指標に行わ
れているが，EPCを用いた治療を行う際に，
期待した治療成果が得られないことが報告
されている．このことは，細胞治療に用い
る EPC の単離方法の検討が必要であるとこ
とを示唆するものである．さらに Yoder ら
のグループは，臍帯血由来 EPC を単離して
シングル・コロニー法を用いて解析するこ
とにより，増殖性の高い細胞から増殖性の
低い細胞まで様々な性質をもった EPC が存
在することを報告している（Blood 2004; 
104: 2752-2760）．すなわち，増殖能に着目
することにより，EPC の階層性（未分化な
EPC；増殖能が高い〜分化した EPC；増殖能
が低い）があることを示唆している．そこ
で得られた知見によると，増殖能が高い臍
帯血由来 EPC での CD34 の発現は，10-30％
であり，継代により CD34 の発現が消失する．
以上のことから，CD34 の発現においてのみ
EPC を単離して細胞治療に用いる方法では
限界があり，高い治療成果を求めるには新
規細胞治療法の研究開発が必須である． 
 
２．研究の目的 
 本申請では，ヒト臍帯血由来 EPCを単離し，
増殖能の解析および細胞表面マーカー・遺伝
子発現解析等を中心とした分化能の解析を
通じ，EPC の性質を明らかにし，新たな EPC
の単離同定とその生体内機能解析を行う． 
 
３．研究の方法 
（平成 20 年度） 
(1) ALDE-low EPC が，ALDE-high EPC と比較
して，虚血部位における治癒効果が高いこと
から，両者間における低酸素応答性について
解析を行う． 
(2) そこで，本申請では低酸素応答転写因
子（Hypoxia inducible factor: HIF）の
中で，特に HIF-1alpha と HIF-2alpha に着
目し，どちらの転写因子が EPC の虚血部位
における治癒に関与しているのかについ
て，siRNA を用いて明らかにする． 
(3) 具体的には，ALDE-low EPC に HIF-1alpha
あるいは HIF-2alpha に対する siRNA を遺伝
子導入し，mRNA レベルにおいて発現低下がみ
られる siRNA について，Real-time PCR 法を
用いてそれら HIF転写因子の標的遺伝子発現
を解析する。 
 
（平成 21 年度） 
(4) それぞれのHIFに対するsiRNAを用い
て，HIF-1alpha あるいは HIF-2alpha の蛋
白質発現低下が見られた ALDE-low EPC に
ついて，以下の実験を行う． 
① 低酸素条件下における標的遺伝子の発
現解析を行う（H20 年度より継続） 
② マウス有茎皮弁移植モデルを用いた虚
血部位における創傷治癒効果の解析を行
う． 
 
（平成 22 年度） 
(5) 虚血発症を誘導したヌードマウスに対
して，生体外において HIF に対するｓiRNA
を遺伝子導入した ALDE-low EPC を移植し，
移植した EPC が血管新生にどのように関わ
っているのかを定量的に評価する． 
① マウス有茎皮弁移植モデルにおいて，壊
死領域の面積を測定し比較検討する. 
② 移植した EPC がどのように血管新生に
寄与するのかについて定量的検討を行う. 
③ 移植した EPC 数と新生血管数の相関に
について検討する（免疫組織染色）. 
④ 新生血管に移植した EPC が取りこまれ
るかについて，GFP 標識した EPC を用いて
行う．全ての血管は lectin-TRIC を用いて
同定する． 
6) EPC において，低酸素に応答してケモカ
インレセプターCXCR4 の発現が増加するこ
とが分かっている．投与方法により，
ALDE-low EPC と ALDE-high EPC の間で血管
新生に差が見られるかについて検討する． 
 
４．研究成果 
(1) ALDE-low EPCに対して，HIF-1alpha siRNA
と HIF-2alpha siRNA をそれぞれ導入した細
胞を作成し，標的遺伝子の発現について解析
をおこなった．VEGF（血管内皮増殖因子）の
発現は，両者において低下していることが分
かった．ケモカインである SDF-1 のレセプタ
ーCXCR４の発現は，HIF-2alpha siRNA を導入
した EPC においてのみ，その発現低下を認め
た．以上の結果により，EPC における CXCR4
の発現は，VEGF とは異なり，HIF-2alpha 特
異的に制御されていることが示唆された． 
(2) それぞれの siRNA 導入 EPC を用いて，マ
ウス有茎皮弁移植モデルにより，創傷治癒効
果について解析を行った．HIF-2alpha siRNA 
EPC では細胞を移植しない群と同程度に創傷
治癒効果を認めない．一方，HIF-1alpha siRNA 
EPC を投与した群では, 細胞を移植しない群
と比較して２倍程度の創傷治癒効果を認め
た．以上のことから，マウス有茎皮弁移植モ
デルでは，HIF-2alpha により発現制御される
標的遺伝子が，大きく関わっていることが明
らかとなった． 
(3) HIF-2alpha siRNA EPC では，VEGF と CXCR4
の発現が，コントロール群と比較して有意に
低下していた．どちらの標的因子がマウス有
茎皮弁移植モデルにおいて，Key となる因子
かについて解析を行った．ALDE-low EPC に対
して，VEGF siRNA と CXCR4 siRNA をそれぞれ
導入した細胞を作成し, マウス有茎皮弁移
植モデルにより,創傷治癒効果について比較
検討した．VEGF siRNA あるいは CXCR4 siRNA
を導入した細胞群は，ともに創傷治癒が正常
EPC 投与群と比較して，有意に低下している
ことが分かった． 
(4) VEGF siRNA あるいは CXCR4 siRNA を導入
した細胞群に対して，マウス有茎皮弁移植モ
デルにより，遊走能について解析を行った．
CXCR4 siRNA EPC では，VEGF siRNA EPC と比
較して，創傷部位における細胞の出現数が大
きく減少していることが明らかとなった． 
(5) 以上の結果より，創傷部位に働く EPCは，
異なる2つの作用(VEGFとCXCR4が関係する)
を介して，創傷治癒に作用していることが明
らかとなった． 
 
５．主な発表論文等 
（研究代表者、研究分担者及び連携研究者に
は下線） 
 
〔雑誌論文〕（計 6件） 
1) Tu T, Kimura K, Nagano M, Yamashita T, 
Ohneda K, Sugimori H, Sato F, Sakakibara Y, 
Hamada H, Yoshikawa H, Son H, and Ohneda O.  
Identification of human placenta-derived 
mesenchymal stem cells involved in 
re-endothelialization.  J Cell Physiol. 
2010; .226: 224-235. 査読有 
 
2) Nagano M, Kimura K, Yamashita T, Ohneda 
K, Nozawa D, Hamada H, Yoshikawa H, Ochiai 
N, and Ohneda O.  Hypoxia responsive 
mesenchymal stem cells derived from human 
umbilical cord blood are effective for 
bone repair.  Stem cells and Dev. 2010; 
19: 1195-1210. 査読有 
 
3) Takano S, Yamashita T, and Ohneda O.  
Molecular therapeutic targets for glioma 
angiogenesis.  J Oncol. 2010; 2010:351908. 
査読無 
 
4) Yamashita T, Ohneda O, Sakiyama A, Iwata 
F, Ohneda K, and Fujii-Kuriyama Y.  The 
microenvironment for erythropoiesis is 
regulated by HIF-2alpha through VCAM-1 in 
endothelial cells. 
Blood 2008; 112: 1482-1492. 査読有 
 
5) Yamashita T, Ohneda K. Nagano M, Miyoshi 
C, Kaneko N, Miwa Y, Yamamoto M, Ohneda O, 
and Fujii-Kuriyama Y.  HIF-2alpha in 
endothelial cells regulates tumor 
neovascularization through activation of 
ephrin A1.  J Biol Chem 2008; 283: 
18926-18936. 査読有 
 
6) Yamashita T, Ohneda O, Nagano M, Iemitsu 
M, Makino Y, Tanaka H, Miyauchi H, Goto K, 
Ohneda K, Fujii-Kuriyama Y, Lorenz 
Poellinger, and Yamamoto M.  Abnormal 
heart development and lung remodeling in 
mice lacking a HIF-related bHLH-PAS 
protein NEPAS.   
Mol. Cell. Biol. 2008; 28: 1285-1297. 査
読有 
 
〔学会発表〕（計 26 件） 
1)山下年晴,小林里美,坪井一輝,長野真澄,
大根田修.腫瘍血管内皮細胞における HIF 機
能の解析. 
第 33 回日本分子生物学会（神戸）2010 年 12
月 7 日〜10 日 
 
2)長野真澄,木村健一,山下年晴,大根田修. 
CXCR4 is crucial for ischemic tissue 
repair through HIF-2 α  in endothelial 
progenitor cells． 
20th World Congress of the International 
Society for Heart Research (Kyoto)2010 年
5 月 13 日〜16 日 
 
3)木村健一,長野真澄,山下年晴,大根田修. 
CD349 is an useful marker to isolate 
placenta-derived mesenchymal stem cells 
in accordance with functional property． 
20th World Congress of the International 
Society for Heart Research(Kyoto) 2010 年
5 月 13 日〜16 日 
 
4)木村健一,長野真澄,山下年晴,秋本恵子,
野澤大輔,杉森治彦,落合直之,榊原譲,大根
田修．脂肪組織由来間葉系幹細胞と骨髄由来
間葉系幹細胞の in vivo 機能解析． 
第 9 回 日本再生医療学会（広島）2010 年 3
月 18 日〜19 日 
 
5)長野真澄,山下年晴,濱田洋美,大根田絹子,
木村健一,吉川裕之,大根田修． 
ヒト血管内皮細胞の虚血改善能における
HIF-2αと CXCR4 の機能解析． 
第 9 回 日本再生医療学会（広島）2010 年 3
月 18 日〜19 日 
 
 
6)山下年晴,長野真澄,坪井一輝,大根田修. 
がん転移形成における HIF-2alpha の機能解
析．第 32 回分子生物学学会（横浜）2009 年
12 月 9 日〜12 日 
 
7)木村健一,Tran Cam Tu,長野真澄，趙陽， 
大根田修.ヒト胎盤由来間葉系幹細胞の単離
およびその機能解析. 第 32 回分子生物学学
会（横浜）2009 年 12 月 9日〜12 日 
 
8)秋本恵子,木村健一,長野真澄,高野晋吾,
山下年晴,大根田修. 
Mesenchymal stem cells is useful for cell 
therapy of glioblastoma multiforme． 
第 32 回分子生物学学会（横浜）2009 年 12 月
9 日〜12 日 
 
9)小林里美,山下年晴,植田崇史,中井秀人, 
長野真澄,大根田修. 
Hypoxia inducible factor-3αの機能解析． 
第 32 回分子生物学学会（横浜）2009 年 12 月
9 日〜12 日 
 
10)山下年晴,長野真澄,坪井一輝,大根田修. 
がん転移巣形成における HIF-2alpha の機能
解析．第七回がんとハイポキシア研究会（京
都）2009 年 12 月 5 日〜6日 
 
11)小林里美,山下年晴,植田崇史,中井秀人, 
長野真澄,大根田修. 
Hypoxia inducible factor-3αの機能解析． 
第七回がんとハイポキシア研究会（京都）
2009 年 12 月 5 日〜6日 
 
12)高野晋吾,山下年晴,長野真澄,大須賀覚,
益子良太,大根田修. 
SDF-1 と CXCR7 はグリオーマの血管新生の重
要な標的分子である．第 68 回日本癌学会学
術総会（横浜）2009 年 10 月 1 日〜3日 
13)木村健一，長野真澄，山下年晴，野澤大
輔，濱田洋実，落合直之，吉川裕之，大根田
修.治療効果の高い間葉系幹細胞の単離およ
びその機能解析． 
日本生化学会 関東支部例会（つくば） 
2009 年 6 月 20 日 
 
14)秋本恵子，木村健一，長野真澄，高野晋
吾，山下年晴，大根田修. 
ヒト間葉系幹細胞を用いたグリオグラスト
ーマの細胞治療と機能解析． 
日本生化学会 関東支部例会（つくば）  
2009 年 6 月 20 日 
 
15)秋本恵子，木村健一，長野真澄，高野晋
吾，山下年晴，大根田修. 
ヒト間葉系幹細胞を用いたグリオグラスト
ーマの細胞治療に向けた研究開発． 
第 8回 日本再生医療学会総会（東京）2009
年 3 月 5日〜6日． 
 
16)木村健一，長野真澄，山下年晴，野澤大
輔，濱田洋実，落合直之，吉川裕之，大根田
修. 
治療効果の高い間葉系幹細胞の単離および
その機能解析．第 8回 日本再生医療学会総
会（東京）2009 年 3 月 5日〜6日． 
 
17)Haruhiko Sugimori ，Masumi Nagano，
Toshiharu Yamashita，Sato F, Matsushita S, 
Ohneda O and Sakakibara Y. Differential 
Potential of Endothelial Progenitor Cells 
to Promote Arteriogenesis and 
Angiogenesis． 
Cardiovascular Research Technologies
（Washington, D.C）2009 年 3 月 4日〜6日 
 
18)Masumi Nagano，Osamu Ohneda. 
CXCR4 Plays a Crucial Role for Repairing 
Ischemic Tissue through Regulation by 
HIF-2・．第 73回 日本循環器学会総会(大阪) 
2009 年 3 月 20 日〜22 日 
 
19)Masumi Nagano，Ken-ichi Kimura，
Toshiharu Yamashita，Hiromi Hamada，Kinuko 
Ohneda，Hiroyuki Yoshikawa，and Osamu 
Ohneda. 
A Chemokine Receptor CXCR4 Plays a Crucial 
Role for Repairing Ischemic Tissue through 
Regulation of HIF-2a． 
50th ASH Annual Meeting（San Francisco） 
2008 年 12 月 6 日〜9日 
 
20)秋本恵子，木村健一，長野真澄，高野晋
吾，山下年晴，大根田修. 
グリオグラストーマにおける HIF-2・の役割． 
第 6回 がんとハイポキシア研究会（広島） 
2008 年 11 月 29 日〜30 日 
 
21)植田崇史，山下年晴，中井秀人，長野真
澄，大根田修. 
生体内における HIF-3・ /IPAS 発現部位の同
定．第 6回 がんとハイポキシア研究会（広
島）2008 年 11 月 29 日〜30 日 
 
22)山下年晴，植田崇史，長野真澄，大根田
修. 
HIF-3・による負の転写制御機構解明． 
第 6回 がんとハイポキシア研究会（広島）
2008 年 11 月 29 日〜30 日 
 
23)高野晋吾，益子良太，長野真澄，秋本恵
子，大根田修，大須賀覚，松村明. 
膠芽腫由来血管内皮細胞の特性から考える
血管新生抑制療法． 
第 67 回 日本癌学会学術総会（名古屋）2008
年 10 月 28 日〜30 日 
 
24)山下年晴，大根田絹子，大根田修. 
赤血球分化における低酸素応答転写因子
HIF-2・の機能解析． 
第 70 回 日本血液学会総会（京都）2008 年
10 月 10 日〜12 日 
 
25)長野真澄，山下年晴，濱田洋実，大根田
絹子，木村健一，中川智貴，吉川裕之，大根
田修.虚血改善効果の高いヒト血管内皮前駆
細胞における低酸素応答転写因子の機能解
析．第 70 回 日本血液学会総会（京都）2008
年 10 月 10 日〜12 日 
 
 
６．研究組織 
(1)研究代表者 
大根田 修（OHNEDA OSAMU） 
筑波大学・大学院人間総合科学研究科・教授 
研究者番号：30311872 
 
(2)研究分担者 
山下 年晴（YAMASHITA TOSHIHARU） 
筑波大学・大学院人間総合科学研究科・助教 
研究者番号：50400677 
 
(3)連携研究者 
長野 真澄（NAGANO MASUMI） 
筑波大学・大学院人間総合科学研究科・助教 
研究者番号：30436282 


Analysis of functional EPC for the treatment of ischemic disease

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