Thesis (Ph.D. in Agriculture)--University of Tsukuba, (A), no. 1072, 1993.3.2

Nagata Naoki

長田 直樹

筑波大学University of Tsukuba博士（農学）Doctor of Philosophy in Agricultural Science1992【要旨】thesi

Nagata, Naoki

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長田, 直樹

Tsukuba Repository  (Tulips-R)

Fermentative production of poly(malic acid) byAureobasidium Sp.A-91著者 Nagata Naoki内容記述 Thesis (Ph.D. in Agriculture)--University ofTsukuba, (A), no. 1072, 1993.3.25発行年 1993URL http://hdl.handle.net/2241/4197　　　　　　　　　　　　　　　　　　　【瑚　　　　　　　　　　なが　　　た　　なお　　　き氏名（本籍）　長田直樹（北海道）学位の種類博士（農学）学位記番号　博甲第1072号学位授与年月日　平成5年3月25日学位授与の要件　　学位規則第5条第1項該当審査研究科　農学研究科学位論文題目　　F眠M酬TAnVEPRODUCnONOFPOLY（MAuCAC1D）BY　　　　　　　　　　λσR亙0BA8五D∫㎜SP．A－91　　　　　　　　　　（んτεoろα∫痂α刎sp．A－91株によるポリリンゴ酸の発酵生産）主　査　　筑波大学教授　　　農学博士　　中　　原　　忠　　篤副　査　　筑波大学教授　　　工学博士　　中　　村　　以　　正副　査　　筑波大学教授　　　農学博士　　富　　田　　文一郎副　査　　筑波大学助教授　　農学博士　　星　　野　　貴　　行論　　文　　の　　要　　旨　ポリリンゴ酸はヨリンゴ酸が分子問でエステル結合により重合した酸性の高分子であり事結合様式の違いによりαヨβおよびその混合型の3種の構造が考えられる。このポリマーは事生体内で加水分解し。生ずるリンゴ酸が生体吸収性であるだけでなく害化学修飾可能なカルボキシル基を持つため雪近年里生体内分解吸収性ポリエステルとしてヨDr㎎De1iverySystem（DDS）への応用が注目を集めている。これまでにポリリンゴ酸の化学合成法が検討されてきたがヨまだ実用化されるに十分な反応収率および分子量は得られていない。生物由来のポリリンゴ酸は里Pθ枕棚舳収／o肋閉の生産するプロテアーゼインヒビターや粘菌の1種であるP伽〃舳力o砂妙肋／㈱の生産するDNAポリメラーゼのインヒビターとして報告されているのみであり、両者とも生産量は極めて微量であった。　本研究では里自然界から新たに分離したλ舳oろα∫励舳sp．A－91株によるポリリンゴ酸の発酵生産ヨポリリンゴ酸の化学構造と物理化学的諸性質の検討および形態変化に注目した変異株の造成を試みた。　最初に好気的代謝の旺盛な酵母の分離を目的としてヨマンニトールを主炭素源とした集積培養で、天然から多数の黒色酵母ヨん㈹oろω励舳属菌を分離した。これらの菌について里グルコースを基質に炭酸カルシウム存在下で培養したところ、菌株によっては菌体外に多量の酸性物質が生産された。この酸性物質は雪培養ろ液にメタノールを添加することによりカルシウム塩として沈殿ヨ回収された。化学的定性反応やPPC骨NMR理IR等の分析によって，供試した黒色酵母の生産物はリンゴ酸の一82一エステル結合による重合物ヨすなわちポリリンゴ酸であると推定された。次にポリリンゴ酸の生産能が最も強いA－91株にっいて，12％のグルコースを基質とし2舵で7日間培養した結果ヨ61gμのポリリンゴ酸カルシウム塩（遊離のポリリンゴ酸として47g／坦に相当）が回収された。ポリリンゴ酸カルシウム塩は蒸留水に再溶解しヨ添加メタノール量を調節することにより3つの画分に分画した。各画分の分子量をGe1Permiation　Chromatography（GPC）で測定した結果，それぞれ12，OOO（主画分）ヨ8，000，6，OOOともとめられた。なおヨポリアニオンであるポリリンゴ酸の分子量をGPCで測定する場合にはヨ移動層に十分なイオン強度を与えるためにラO．2Mのリン酸緩衝液（pH6．8）を用いた。主画分の水溶液をイオン交換樹脂により脱カチオン処理後冒凍結乾燥して遊離のポリリンゴ酸を得た。この遊離のポリリンゴ酸について吾酸およびアルカリ条件下での加水分解挙動を調べた。分解挙動はポリリンゴ酸の生体内分解吸収性高分子としての応用を検討する上で重要と考えられる。ポリリンゴ酸を100℃加熱下ヨ酸加水分解した場合盲反応5時間後にポリマーの98％がL一リンゴ酸モノマーとして回収された。残りの2％はフマル酸およびマレイン酸であった。ポリリンゴ酸はアルカリに非常に不安定でありう室温で速やかにけん化を受け分解した。この場合ラ酸加水分解と異なりL一リンゴ酸以外に生成したフマル酸およびマレイン酸は全体の約20％に達した。なお雪共同研究者の藤重らはヨ本ポリマーをリン酸緩衝液中（pH6）ラ室温下という温和な条件で自己触媒的に加水分解するとヨ分解産物としてL一リンゴ酸のみが得られることを報告している。以上の実験事実に基づき雪アルカリおよび酸加水分解時に不飽和二塩基酸が生成する原因について考察した。分解反応速度が非常に速い場合、分解時に水の付加が遅れラその結果として不飽和二塩基酸が生成するという考え方を示した。またヨD雌ere就捌Sca㎜1∬g　Ca1od鵬try（DSC）により水の付加を可及的に抑えた条件下でポリマーの熱特性を調べたところヨ醐℃に分解点がみられヲフマル酸およびマレイン酸を順次生じつつ熱分解した。本ポリマーのガラス転移点および融点についてはDSCで観察されなかった。　続いて菅分離したポリリンゴ酸のNMRによる一次構造の解析を進めた。遊離ポリリンゴ酸とそのカルシウム塩のNMRスペクトルおよび種々のpR条件下でのNMRスペクトルを比較検討した結果，本ポリマーの主鎖はβ一型であることが明らかとなった。さらに分枝構造の有無を調べるため事加熱時での自已触媒的加水分解の挙動を追跡することにより事NMRでの主鎖および末端由来のシグナルの帰属を行った。本ポリマーの分子量が12，OOOと大きいにもかかわらず事主鎖のシグナルに比べて末端のシグナルがより強く検出されたことから雪分枝構造を有するものと判断された。以上の知見を総合してA舳oろos励舳sp．A－91株の生産するポリリンゴ酸は事分枝構造を有する（β一L一ポリリンゴ酸）であることが判明した。　次にA－91株によるポリリンゴ酸の生産条件を検討した。鉄イオンの添加はポリリンゴ酸の生産量を増加させたが官一方。ポリリンゴ酸からプルランヘの発酵転換を強く促進した。この影響はヨ培地への亜鉛イオンの添加により抑制された。硫酸鉄5鯛言硫酸亜鉛2卿を含む培地を用い、2舵7日間の回転振邊培養において事12％のグルコースから盗．7％のポリリンゴ酸が生産され牟。また事3菌種ラ17菌株のA舳oあα∫励舳属菌についてもポリリンゴ酸の生産性を調べたところ事λ．μム一83一／肋郷4菌株とλ．榊郷o〃五菌株がポリリンゴ駿を生産した。　A舳oろos励榊sp．A－91株は不完全菌に属しヨ培養時において酵母状のみならず菌糸状の細胞も生じる。このことが本菌の大量培養時の培養管理を困難にする、ことが予想されたので皇酵母状の細胞をとり続ける形態変異株の造成を試みた。変異株の造成はシクロヘキシミド耐性を選択マーカーとして持つ親株をエチルメタンスタンスルフォネート処理することにより行った。その結果ラ2％モルツアガー培地上で菌糸の形成を示さない変異株CE－9亙を含む数種の変異株を得ることができた。CE－9亙株のポリリンゴ酸生産活性はA－9亙株の約80％であった。審　　査　　の　　要　　旨　本研究は、天然から分離したA鰍oあos励㈱sp．A－91株によるポリリンゴ酸の発酵生産についての一連の研究をまとめたものである。　まず菅非発酵性のマンニトールを含む選択培地を工夫し里新たに多数の黒色酵母ヨA㈱oろα∫倣舳属菌を分離した。そのうちA－91株が菌体外に多量の酸性物質を蓄積することを見出し曹各種化学分析の結果、ポリリンゴ酸であることを確認しえた。メタノール沈殿により回収した本ポリリンゴ酸の分子量は争合成物に比べ高い値を示した。次にポリリンゴ酸の分解挙動をアノレカリおよび酸触媒下で調べ争L一リンゴ酸以外にフマル酸とマレイン酸の不飽和二塩基酸が生成するという新しい現象を観察した。なお自己触媒的加水分解においてはL一リンゴ酸のみを与える。熱分解についても検討を加えている。さらにポリリンゴ酸のNMRによる一次構造の解析を進めラ本ポリリンゴ酸が分枝構造を有するポリ（β一L一リンゴ酸）であることを明らかにした。一方曾生産学的観点から生産条件を検討し纈鉄イオンの制隈と亜鉛イオンの添加が有効なことを見出した。形態変化に注目した変異株の造成も行っている。今後はポリリンゴ酸の生合成機構について酵素レベルでの研究が必要であろう。　以上官本研究は芽新たに分離したA㈱oろo∫倣㈱属菌を用いてヨD醐gDe11verySystemにおいて薬剤担体としての応用が注目されているポリリンゴ酸の効率的な発酵生産に成功している。生産学的観点からだげでなく、ボリリンゴ酸の物理化学的性質を詳細に検討し事新しい基礎的知見を加えており。本研究は盲基礎1応用の両面から高く評価される。　よってヨ著者は博士（農学）の学位を受けるに十分な資格を有するものと認める。一8逸一

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