Thesis (Ph.D. in Agriculture)--University of Tsukuba, (A), no. 1648, 1997.3.2

Shibuya Hajime

澁谷 源

筑波大学University of Tsukuba博士（農学）Doctor of Philosophy in Agricultural Science1996【要旨】thesi

Shibuya, Hajime

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澁谷, 源

Tsukuba Repository  (Tulips-R)

Biochemical studies on α-Galactosidases fromfungi著者 Shibuya Hajime内容記述 Thesis (Ph.D. in Agriculture)--University ofTsukuba, (A), no. 1648, 1997.3.24発行年 1997URL http://hdl.handle.net/2241/3721　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　臣瑚　　　　　　　　　　　しぷ　　　や　　　　　　はじめ氏名（本籍）　濫谷　　源（埼玉県）学位の種類博士（農学）学位記番号　博甲第1，648号学位授与年月日　　平成9年3月24日学位授与の要件　　学位規則第4条第1項該当審査研究科　農学研究科学位論文題目　　蜘C舵洲C糺S刑旺S㈱α一蝕雌C↑◎S脳S匿S開㈱則繍α　　　　　　　　　　　（糸状菌のα一ガラクトシダーゼの生化学的研究）主　査　　筑波大学教授　　　　　農学博士　　日下部　　　功副査　筑波大学教授　　農学博士　村上和雄副査筑波大学教授　　農学博士　田中可昌副査　筑波大学併任助教授　農学博士　小林秀行　　　　　（食品総合研究所）論文の内容の要旨　自然界には非還元末端にα一ガラクトース残基を有する物質が多く存在し，これらからのガラクトース残基の遊離にα一ガラクトシダーゼが利用されている。酵素を用いる際にはその諸性質，特に基質に対する特異性を明らかにすることが重要である。さらに酵素を目的にあわせて改変し，より効率的な利用をめざすには，酵素の諸性質を明らかにした上で構造と機能の関係を知る必要がある。そこで著者はガガラクトシダーゼを精製し，その諸性質を調べ，クローニングを行い，その一次構造を明らかにした。さらに，酵素の構造と機能の相関に対する研究に必要な発現系を確立させた。　Mo伽舳α伽αo召αのα一ガラクトシダーゼ皿とP舳｛6伽舳〃ゆ舳g脇〃伽のα一ガラクトシダーゼをそれぞれ培養上澄から精製し，その諸性質を調べ，すでに報告されているM伽αoωのα一ガラクトシダーゼIの性質と比較した。いずれの酵素も糖タンパク質であり，M伽α6ωのグガラクトシダーゼ亙は四量体，〃伽αoωのα一ガラクトシダーゼHとPμゆ舳og舳伽のα一ガラクトシダーゼは単量体であった。〃伽αoθαのα一ガラクトシダーゼnは糖鎮を酵素的に除去すると不溶性になることから，糖鎖が酵素の可溶化に重要な役割を果たしていることが示唆された。また，この酵素は低濃度では不安定であった。ガラクトマンノオリゴ糖に対する酵素の特異性について検討した結果，M伽αoωのα一ガラクトシダーゼエは末端ガラクトース残基に特異的に作用したが，Rμゆ舳g2〃㈱のα一ガラクトシダーゼは側鎖ガラクトース残基に特異的であった。一方，M〃伽α6ωのα一ガラクトシダーゼ亙は末端と側鎖の両ガラクトース残基に作用した。M伽α6ωのα一ガラクトシダーゼIとR〃作〃og㈱肌のα一ガラクトシダーゼはガラクトマンナンに作用しなかったが，M〃｛〃α6召αのα一ガラクトシダーゼ皿はガラクトマンナンからガラクトースを遊離しマンナンの沈澱を生じさせた。このことはこの酵素を用いて安価なグアーガムのガラクトース含量を減らすことによってローカストビーンガムの代用とすることが可能であることを示している。α一ガラクトシダーゼnで処理したグアーガムはローカストビーンガムと同様，キサンタンガムとの相互作用によってゲルを形成することを実証した。　M伽α6ωのα一ガラクトシダーゼ亙とH，そしてR〃物γo解％舳のα一ガラクトシダーゼをクローニングした結果，これらのアミノ酸配列は真核生物由来の既知のα一ガラクトシダーゼと28－49％の相同性が，見られた。〃伽α6θαのα一ガラクトシダーゼ亙は酵母のα一ガラクトシダーゼと相同性が高く，さらに酵母のα一ガラクト一122一シダーゼに共通して存在しているシステインやプロリンに富んだ特徴的な挿入配列も保存されていた。一方，〃．伽α6ωのα一ガラクトシダーゼnはガラクトマンナンからガラクトースを遊離することができるグァーやコーヒーのα一ガラクトシダーゼとの相同性が比較的高かった。Rμゆ舳g㈱㈱のα一ガラクトシダーゼはこれらの申では相同性が低く，ほかの酵素にはみられない挿入配列も存在した。〃伽α6ωのα一ガラクトシダーゼ亙と皿については，さらに酵母による発現を試み，培養上澄からそれぞれの組み換え酵素を精製した。組み換え酵素はネイティブ酵素に比べ大きな糖鎖が付加されており，比活性はネイティブ酵素の半分程度であった。両酵素の至適pHや温度には違いが見られなかったが，組み換えα一ガラクトシダーゼ皿は低濃度での不安定な性質が改善された。ガラクトマンノオリゴ糖に対する特異性には組み換え酵素とネイティブ酵素との聞に違いはみられなかった。　以上の研究によって明らかになったα一ガラクトシダーゼの諾性質や一次構造，さらに発現系の確立の結果はα一ガラクトシダーゼの構造と機能の相関に関する研究の進展に貢献し，酵素の利用，改変につながるものであると期季寺される。審査の結果の要旨　植物界にはα一ガラクトース結合を含む多糖（ガラクトマンナン）が豊富に存在し，一方，それを切断するグガラクトシダーゼも植物や微生物に広く存在している。このような関係から，多種多様なα一ガラクトシダーゼが種々の起源から発見されており，それらの酵素の酵素化学的性質や，食品製造への利用についての研究が行われている。しかし，酵素の効率的な利用を目指す上で，酵素の構造と機能の関係を解明する研究や多糖からガラクトース結合を切断することを目的とした研究は見当たらない。　このような現状から，著者は遺伝子工学的手法によって酵素の一次構造を明らかにする研究を手掛け，その結果，これまでに発見されている数種の酵素の構造を解明した。一方，これまでにガラクトマンナンからガラクトースを遊離する酵素は知られていなかったがラ〃伽α08αからそれを可能にする新規な酵素を発見した。この酵素はガラクトマンナンのガラクトース含量を自由にコントロールすることが可能であり，その結果，これまでにゲル化能を持たないガラクトマンナンをゲル形成能を持つ多糖に変換できることを実証した。　著者が提示した一連の基礎研究の結果は，糖質関連酵素化学の発展に寄与したことに止まらず，著者が発見した酵素は食晶製造に応用できる実用的なデータを提示した点においても高く評価できる。　よって，著者は博士（農学）の学位を受けるに十分な資格を有するものと認める。一123一

Biochemical studies on α-Galactosidases from fungi

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