Thesis (Ph. D. in Science)--University of Tsukuba, (A), no. 2779, 2002.3.25Includes bibliographical reference

Nakamura Tomohiro

中村 智尋

Tsukuba Repository

Studies on molecular mechanisms of induction
of bovine luteal cell apoptosis by oxidative
stress
著者 Nakamura Tomohiro
内容記述 Thesis (Ph. D. in Science)--University of
Tsukuba, (A), no. 2779, 2002.3.25
Includes bibliographical references
発行年 2002
URL http://hdl.handle.net/2241/5728
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　　　　　　　　　　　なか　　むら　　とも　　ひろ
氏名（本籍）　　中　村　智　尋（東　京　都）
学位の種類博士（理学）
学位記番号　博甲第2779号
学位授与年月日　　平成14年3月25日
学位授与の要件　　学位規則第4条第1項該当
審査研究科　　生物科学研究科
学位論文題目　　S池diesonM◎1ec蝸r晦ch鮒ismsof1池ctionof8oviηeL晩a1Cel■Ap◎ρtosisbyOxidati・e
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　　　　　　　　　　　（酸化ストレスによるウシ黄体細胞のアポトーシス誘導機構に関する分子生物学的研究）
主査　筑波大学教授　理学博士　山根國男
副査　筑波大学教授　農学博士　田仲可昌
副査　筑波大学教授　理学博士　沼田　治
副査　筑波大学助教授　理学博士　坂本和一
論文の内容の要旨
　黄体は排卵後の卵胞より分化し，黄体ホルモンを産出することで子宮内膜の肥大などを促す働きを持つが，発
情周期後期になると子宮より分泌されるプロスタグランジン（PG）F。、の作用で黄体細胞のアポトーシスによる
黄体退縮が導かれる事が知られている。黄体退縮は次の性周期を促し，正常な性周期の進行には必須の生理現象
であることから，このメカニズムの解明は卵巣や子宮における生殖生理機構の解明や種々の生殖器疾患の治療に
大きく貢献することが期待できる。そこで本研究は，ウシ黄体細胞のアポトーシスの誘導機構を分子レベルで明
らかにすることを目的とし，その制御因子の同定を試みた。
　まず，黄体細胞のアポトーシス制御因子を同定するために，ウシ発情周期の黄体より抽出した全RNAを用いて
Di旋rentiamisp1ay（DD）法を行ったところ，初期・中期黄体においてMnsuperoxidedismutase（SOD）の発現の
上昇が認められた。そこで，黄体細胞のアポトーシスには酸化ストレスが深く関与しているのではないかと考え，
嚇SOD以外の抗酸化酵素の発現量を調べた結果，g1utathioneperoxidase（GPx）の発現が黄体体縮の始まる後期
で著しく減少していた。これは，初期・中期黄体における高いSOD活性により生じたH。○。が，後期黄体ではGPx
が減少しているために十分に消去されなくなることを意味し，その結果蓄積したH．O。が黄体細胞のアポトーシス
を活性化していることが考えられた。実際に，酸化ストレスマーカーである8－hy血oxγ2’一deoxyguanosine（8一○HdG）
のDNA内の蓄積量が後期黄体で最大となっており，しかも黄体細胞の初代培養細胞をH。○。とGPx阻害剤で処理
すると顕著にアポトーシスが誘導された。従って，後期黄体におけるGPxの発現量の減少がH。○。の蓄積を招き，
黄体細胞死のシグナルカスケードを活性化していることが明らかになった。
　さらに，酸化ストレスによる黄体細胞のアポトーシス誘導のシグナル機構をより詳細に解明するために，黄体
細胞をH。○。で刺激した際にどのような遺伝子の発現が活性化されているのか解析した。まず，既に黄体体縮への
関与が報告されている遺伝子についてPCR法やNorthem　hybridizati㎝法により発現量の変化を調べたところ，
Cyc1ooxygenase（COX）2，p53およびB孤の㎜RNAの発現上昇が観察されたが，C○口，PGF。。受容体，PGF。肛合
成酵素および各種抗酸化酵素類に変化は認められなかった。加∫肋Hybridizati㎝の緒果，COX2，p53およびBax
はいずれも8一○HdGの蓄積細胞である大型黄体細胞に特異的に発現していることが確認された。さらにDD法を用
いて酸化ストレス刺激で発現が増加するmRNAを検索したところ，Forkhead型転写因子であるFK服の発現が増
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加する事を見出した。このmRNAの発現部位も大型黄体細胞であったことから，加伽oにおいてもこれらmRNA
は酸化ストレス刺激に応じて発現が上昇していることが示唆された。また，FK眠の発現は退縮期でのみ特異的に
認められたことから，特にアポトーシス実行系への関与が考えられた。以上の緒果より，黄体細胞内での酸化ス
トレスの上昇はCOX2，p53，BaxおよびFKHRの発現増加を導き，黄体細胞のアポトーシスを誘導する重要な制
御因子として作用していることが明らかになった。
審査の結果の要旨
　黄体は黄体ホルモンを分泌して受精卵の着床と妊娠の成立に必要不可欠な機能を持つが，その働きは一定の性
周期に従った黄体の退縮，すなわち黄体細胞のアポトーシスにより維持されている。本論文は，ウシ黄体細胞の
アポトーシスを誘導する制御因子を同定し，黄体退縮の誘導機構を分子レベルで解明することを目的としたもの
である。本研究では，退縮直前のウシ後期黄体におけるGPxの発現の減少と，それによるH。○。の蓄積が黄体細胞
のアポトーシスの直接の引き金になることを明らかにした。さらに，H。○。刺激による酸化障害の蓄積が，p53，B孤
およびCox－2などのアポトーシス誘導遺伝子の活性化につながることを黄体細胞において初めて明らかにした。本
研究は，黄体退縮の基本原理の解明という学術的な意義があるばかりでなく，不妊症など生殖器系疾患の原因解
明や治療法の開発にとって極めて重要な意義を持つものである。
　よって，著者は博士（理学）の学位を受けるに十分な資格を有するものと認める。
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Studies on molecular mechanisms of induction of bovine luteal cell apoptosis by oxidative stress

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