Nachdem weder ein uterines Luteolysin noch ein Mangel an Gonadotropinen (LH, Prolaktin) kausal mit der ab dem ersten Drittel des
Diöstrus einsetzenden Luteolyse in Zusammenhang gebracht werden kann, lag vorliegender Arbeit die Arbeitshypothese zugrunde, dass
auch beim Hund - analog zur Situation bei anderen Spezies - luteale Steroidhormone als parakrine/autokrine Faktoren eine Rolle bei der
Steuerung der Corpus luteum Funktion spielen.
Da eine solche Wirkung an die Expression spezifischer Rezeptoren gebunden ist, war es Ziel vorliegender Arbeit im Hinblick einer
Verifizierung der aufgestellten These, die Expression von Progesteron- und Östrogenrezeptoren im Verlauf des Diöstrus im Corpus luteum
ingravider Hündinnen zu erfassen.
Die Untersuchungen erfolgten immunhistochemisch unter Verwendung spezifischer Antikörper und Einbeziehung externer und interner
Kontrollen.
Bei jeweils 4 Hündinnen unterschiedlicher Rassen wurden an den Tagen 5, 15, 25, 35 und 45 nach der Ovulation die Ovarien mittels
Ovariohysterektomie entnommen, die Corpora lutea separiert, und für die Immunhistochemie in 4% Lilliformol fixiert und anschließend in
Paraffin eingebettet. 3 µm dicke Schnitte, aufgezogen auf mit Aminopropyltriethoxysilan beschichtete Objektträger, wurden durch eine
Xylol-Alkohol Reihe entparaffiniert, rehydriert und zur Demaskierung der Epitope einer Mikrowellenbehandlung mit Citratpuffer unterzogen.
Zur Inaktivierung der endogenen Peroxidase folgte eine Überschichtung mit Wasserstoffperoxid in PBS-Puffer, zur Blockierung
unspezifischer Proteinbindungsstellen die Überschichtung mit inaktivierten Pferdeserum; es schloss sich der immunhistochemische
Rezeptornachweis an. Zum Nachweis von Progesteron- und Estradiol-17b-Rezeptoren kamen Antikörper aus dem Klon 10A9 bzw. 6F11
zur Anwendung. Externe Kontrolle war Uterusgewebe vom 15. Tag post ovulationem, interne Kontrollen waren die periluteal liegenden
Follikel. Zur Überprüfung unspezifischer Bindung an caninem Gewebe wurden in jedem Test zusätzliche Schnitte mitgeführt, bei denen der
spezifische Primärantikörper durch einen \u27nonsens\u27 Antikörper aus dem Klon 7T4-1F5 bzw. CBL-600 in entsprechender Endverdünnung
des Proteins ersetzt wurde. Die lichtmikroskopische Auswertung der Präparate erfolgte bei 400-facher Vergrößerung.
Pro Hund wurde ein Paraffinblock, d. h. ein Corpus luteum, herangezogen. Von diesem Block wurden 3 Schnitte gefärbt. Ausgezählt
wurden je nach Schnitt 13 bis 21 Gesichtsfelder, wobei einem imaginären Kreuz gefolgt wurde. Die statistische Auswertung erfolgte mit
dem Statistikprogrammpaket BMDP/Dynamic, Release 7.0 (Dixon 1993).
Zu allen Untersuchungszeitpunkten ergaben sich Färbereaktionen, die das Vorkommen von PR und ER sowohl in den Luteinzellen als auch
in den sonstigen Zellen anzeigten, wobei bei den Luteinzellen im Hinblick auf die nukleäre Reaktion zwischen \u27positiven\u27 und \u27schwach
positiven\u27 Zellen differenziert werden konnte. Daneben ergaben sich auch zytoplasmatische Signale. Weiterhin zeigten sich, bezogen auf
die Lokalisation, mehr positive Reaktionen in den Randfeldern als in den mittleren Feldern. Nur für den PR ließ sich ein Bezug zum
Zeitpunkt der Probenentnahme feststellen, obwohl die Expression des ER positiv mit der des PR korreliert war. Die
Progesteronkonzentration im peripheren Plasma korrelierte negativ mit der Zahl der PR exprimierenden Luteinzellen und sonstigen Zellen.
Diese Befunde weisen erstmals darauf hin, dass beim Hund den lokal im CL gebildeten Sexualhormonen Progesteron und Estradiol-17b
eine parakrine bzw. autokrine Funktion bei der Regulation der CL-Funktion zukommt. Inwieweit die Regulation der Expression der ER und
PR im CL von den lokalen Verfügbarkeit von Progesteron und Estradiol-17b abhängt, kann derzeit nur spekulativ vermutet werden.In the dog neither an uterine luteolysine nor a lack of gonadotropins (LH, Prolaktin) seem to be functionally correlated to luteolysis which
commences after the first third of diestrus. As a result of these observations the hypothesis was developed that in the dog, as in other
species, steroid hormones of luteal origin act as local paracrine/autocrine factors controlling luteal function.
In order to test for this hypothesis the present work deals with the determination of progesterone and estrogene receptors during the course
of diestrus in corpora lutea of non-pregnant bitches. Immunhistochemical methods were applied using specific antibodies and adequate
external and internal controls.
Four bitches of different breeds were ovariohysterectomized on days 5, 15, 25, 35 and 45 after ovulation, corpora lutea were separated
from the ovaries obtained, fixed with Lillie formole (4%) and embedded in paraffin; 3 µm slices were placed on slides coated with
aminopropyltriethoxysilane. The samples were then deparaffinized and dehydrated by treatment with xylene and alcohol, followed by a
microwave treatment in citrate-buffer for retrieval of epitopes. Endogenous peroxidase was inactivated by treatment with hydrogene
peroxide in phosphate buffered solution, unspecific binding sites were blocked by incubation with horse serum prior to performing the
immuncytochemical reaction. Antibodies derived from the clones 10A9 and 6F11 were used for detection of progesterone and
estradiol-17b receptors, respectively. Uterine tissue obtained from a bitch 15 days after ovulation served as external control, follicles in
periluteal position served as sample inherent (internal) controls. To test for unspecific bindig in additional control samples the specific
primary antibody was replaced by a nonsens-antibody derived from the clones 7T4-1F5 and CBL-600, respectively. Nonsens and primary
antibodies were used in the same dilution. All slides were evaluated using a 400-fold magnification.
Evaluation was restricted to one corpus luteum per dog. From each corpus luteum 3 slides were prepared, evaluation followed an
imaginary cross yealding between 13 to 21 views per slide. The program BMDP/Dynamic, Release 7.0 (Dixon 1993) was used for
statistical evaluation.
At all time-points investigated positive staining reactions were observed, indicating the presence of progesterone and estradiol receptors
in luteal cells as well as in other cells. In respect to luteal cells a distinction was possible between positiv and weakly positiv nuclear
reactions. Luteal cells also showed a cytoplasmic signal. There was a higher incidence of positive stained cells in the periphery and only
the expression of the progesterone receptor was correlated to the stage of cycle. However, expression of the estrogene receptor was also
positively correlated to the expression of the progesterone receptor. Progesterone concentrations in peripheral plasma were negatively
correlated to the number of luteal cells expressing the progesterone receptor and the other progesterone receptor-positive cells.
These are the first results indicating a paracrine/autocrine role of progesterone and estradiol in the regulation of luteal function in the dog.
The observations warrant further studies to test for control of the expression of progesterone and estrogene receptors in the corpus luteum
and the role of local luteal hormone concentrations
