Identification and analysis of allergenic substances in atmospheric particulate matter acting as a carrier of toxic-harmful compounds into human respiratory tract

Abstract

Il bioaerosol è presente sia in ambienti indoor che outdoor e può avere diverse sorgenti e, di conseguenza, diversa composizione, concentrazione e distribuzione nelle diverse frazioni granulometriche del particolato. Identificare quali agenti allergenici specifici, responsabili degli effetti negativi sulla salute umana, siano presenti nel bioaerosol è essenziale per stabilire strumenti di valutazione dell'esposizione. Pertanto, scopo del presente progetto è stato di mettere a punto o rendere più affidabili dei metodi di estrazione ed analisi di composti utili per dare informazioni sull’allergenicità dell’atmosfera nel materiale particolato (PM) a diverse granulometrie. In particolare è stata migliorata l’affidabilità del metodo per l’analisi di ergosterolo mannitolo e arabitolo quali bioindicatori delle spore fungine. Sono stati inoltre sviluppati un procedimento analitico per la determinazione nelle PM delle micotossine quali metaboliti secondari dei funghi e un metodo per l’estrazione e l’analisi di amminoacidi liberi e materiale proteico totale quali bioindicatori più generici del bioaerosol. Gli amminoacidi liberi vengono emessi in atmosfera da piante ed animali e provengono dalla degradazione di peptidi e proteine in atmosfera per reazioni enzimatiche e fotocatalitiche. Peptidi e proteine provengono da batteri, funghi, acari della polvere, pollini, peli di animali e muffe. Al fine di studiare la presenza delle spore fungine aerodisperse, abbiamo analizzato il contenuto di ergosterolo, arabitolo, e mannitolo, quali biomarcatori, nel particolato atmosferico a diverse granulometrie. Dopo aver effettuato lo studio dell’effetto matrice ad opera di eventuali interferenti presenti in polvere urbana sugli analiti di nostro interesse, le particelle campionate sui filtri sono state estratte purificate e analizzate per i due polioli e per lo sterolo. Tuttavia i tre marcatori hanno mostrato di essere diversamente distribuiti nelle frazioni granulometriche dell’aerosol, provando di avere sorgenti diverse. L’ergosterolo ha dimostrato di essere l'unico tracciante affidabile alle nostre latitudini, probabilmente a causa della bassa concentrazione di spore fungine che rende significativa la presenza delle altre fonti locali di mannitolo e arabitolo, quali la combustione di biomassa, spruzzi di mare ed emissioni da piante. Inoltre, al fine di sostenere la combustione della biomassa come ulteriore sorgente di arabitolo e mannitolo nel bioaerosol, le loro concentrazioni sono state confrontate con i contenuti di xilitolo e levoglucosano nelle stesse frazioni di particolato, avvalorando tale ipotesi. 2 Le concentrazioni di spore fungine sono state perciò calcolate utilizzando il solo ergosterolo come biomarcatore, attraverso un fattore di conversione che lo correla ad esse, in due siti di campionamento, uno suburbano/rurale e uno urbano, dove il materiale particolato è stato collezionato in diversi periodi stagionali. Lo studio ha mostrato che le spore fungine sono mediamente distribuite nelle sole frazioni granulometriche con diametro aerodinamico 0,65 μm. Le concentrazioni trovate sono rispettivamente inversamente e direttamente proporzionale alla temperatura atmosferica e all’umidità relativa e sono più abbondanti in autunno presso il sito suburbano/rurale e in inverno presso il sito urbano. A seconda del sito di campionamento e della stagione, tra lo 0,1 e lo 0,8 % di PM10 e tra lo 0,3 e il 2,4 % di OC è costituito da spore fungine. In condizioni favorevoli di pH, umidità, temperatura, presenza di substrati, funghi filamentosi possono produrre micotossine, come metaboliti secondari. Pertanto, un metodo analitico finalizzato alla determinazione di micotossine in tracce, nei campioni di particolato atmosferico, è stato sviluppato e applicato a campioni raccolti in ambienti interni ed esterni, sui quali era stata verificata la presenza di spore fungine. Per questo studio, sono state prese in considerazione cinque micotossine: l'aflatossina B1, l’ocratossina A, la tossina T-2, lo zearalenone e la fumonisina B1, scelte, a seguito dell’esame della letteratura, sulla base di studi effettuati in precedenza in altre matrici reali. Per esse è stato sviluppato un metodo analitico per la loro determinazione simultanea, utilizzando l’HPLC-MS/MS. A questo scopo, si è proceduto con lo studio della frammentazione in spettrometria di massa e della separazione cromatografica; è anche stata ottimizzata la procedura di estrazione e la purificazione su cartucce SPE. Sono stati calcolati i recuperi dell’intero metodo analitico (tra il 40 e l’80%), e i LOD che hanno mostrato di essere sufficientemente bassi per tutte le micotossine. Il metodo sviluppato è stato applicato a campioni di particolato sia outdoor che indoor. La presenza di micotossine non è stata rivelata in nessuno dei campioni analizzati. Infine, sono stati presi in considerazione gli amminoacidi liberi e combinati presenti nel materiale particolato atmosferico. Le proteine sono una delle classi più abbondanti di allergeni cui il sistema immunitario può rispondere. La loro presenza in atmosfera, così come quella di amminoacidi liberi, può essere un indice sia del materiale biologico disperso, sia dell’allergenicità dell'atmosfera sotto studio. Pertanto, nell’ambito di questo progetto di dottorato, è stato proposto un metodo per la rivelazione di amminoacidi non derivatizzati mediante cromatografia liquida ad alta risoluzione accoppiata a spettrometria di massa tandem (HPLC-MS/MS) in modalità Multiple Reaction 3 Monitoring (MRM). In particolare, lo studio si è focalizzato sull'applicazione di questo metodo per la determinazione di tali composti in particelle di dimensioni diverse, tra cui la frazione ultrafine. Poiché non vi sono materiali di riferimento standard (SRM) con valori certificati per gli amminoacidi, la loro estrazione, purificazione ed analisi è stata ottimizzata con la polvere urbana SRM 1649a del National Institute of Standards and Technology, sebbene gli amminoacidi non siano presenti nel certificato di analisi. Dopo estrazione ad alta pressione e temperatura con H2O/MeOH 80:20, è stata eseguita una purificazione con due cartucce SPE in serie, per garantire l'analisi in tracce di tali composti in una matrice particolarmente complessa come il particolato atmosferico. Grazie alle fasi di purificazione e all'analisi in HPLC/MS-MS in modalità MRM, è stato possibile ottenere una determinazione senza interferenze ed un aumento del rapporto segnale-rumore (S/N) degli amminoacidi non derivatizzati. Il presente metodo, adatto alla polvere urbana SRM 1649a, è stato applicato a campioni collezionati in atmosfera reale. Le concentrazioni di amminoacidi liberi nelle particelle atmosferiche sospese ultrafine, fine e coarse, sono rispettivamente 12,05, 21,18 e 7,64 ng m-3 con una concentrazione totale nel PM10 di 40,9 ng m-3. Serina, alanina, glutammina, treonina e glicina sono i più abbondanti amminoacidi in atmosfera. In particolare la serina è la più abbondante, pari al 28% del totale di amminoacidi liberi. Il contenuto percentuale p/p degli amminoacidi liberi nelle tre frazioni ultrafine, fine e coarse del particolato risultano rispettivamente 0,67, 0,22 e 0,04 %, e rappresentano circa lo 0,2 % in peso di materiale particolato PM10 urbano. Gli amminoacidi collezionati con diversi tempi di campionamento, con l’impattore multistadio e con il campionatore di PM10 sono del tutto comparabili. Questo dimostra l’assenza di eventuali enzimi nel materiale particolato campionato che potrebbero degradare le proteine e i peptidi a causa della durata del campionamento. Sono state anche studiate le proteine su campioni di polvere urbana a diversa granulometria, per avere informazioni, in particolare, sulle particelle ultrafine. Il metodo di estrazione di amminoacidi combinati in campioni di particolato nell'aria ha previsto tre soluzioni in serie: A) soluzione acquosa di NaCl 0,02 M; B) 20% (v/v) propanolo, ditiotreitolo (DTT) 1 mM, 1% (v/v) soluzione acquosa di acido acetico; C) tampone Tris-HCl pH = 8, sodio dodecil solfato (SDS) 0,005%, DTT 1 mM. I diversi valori di pH e forza ionica, l'impiego di tensioattivi e di agenti redox garantisce l'estrazione di amminoacidi combinati con differenti caratteristiche di solubilità. 4 Il metodo di analisi ha previsto l’utilizzo di un kit di quantificazione con reagente NanoOrange, che, interagendo con le proteine, forma un complesso fluorescente che emette a 570 nm a seguito di eccitazione a 470 nm. La concentrazione proteica atmosferica è risultata di 1,6 mg m-3, che rappresenta il 6% p/p del PM10. Il contenuto percentuale p/p di amminoacidi combinati è pari al 21% nella frazione ultrafine, 7 % nella frazione fine e del 3 % nella frazione coarse. La distribuzione dimensionale degli amminoacidi liberi e combinati dimostra una maggiore percentuale p/p nella frazione ultrafine delle particelle. Pertanto amminoacidi e proteine sono in grado di raggiungere le regioni alveolari di scambio e di penetrare nel sistema cardiovascolare, causando eventuali effetti negativi sulla salute umana. In conclusione, nella frazione ultrafine del materiale particolato le spore fungine non vengono rivelate, mentre gli amminoacidi liberi e combinati costituiscono circa il 22% della quantità totale atmosferica. Poiché tali particelle in gran parte sfuggono la sorveglianza dei macrofagi alveolari ed è così loro garantito l'accesso agli interstizi polmonari, esse e le componenti di cui sono costituite possono raggiungere, tramite il sangue, il sistema cardiovascolare, la milza, il fegato, il cervello, dove possono causare reazioni chimiche avverse ed esplicare perciò la loro nocività. Pertanto, il campionamento e l'analisi della composizione chimica e lo studio delle particelle ultrafine sono da considerarsi essenziali per comprendere i danni potenziali nell'ambiente e il loro impatto sulla salute umana, anche al fine di migliorare la corrente legislazione