Fil: Ulacco, Iago Nicolás. Instituto Balseiro. ArgentinaSe caracterizó la linea celular MDCK-II mediante la técnica ECIS. Se observó la evolución de cultivos ante ensayos de herida eléctrica y cicatrización. Se observó una reducción en la impedancia del sistema, correspondiente a muerte celular y el posterior aumento por cicatrización del tejido. También se implementó un arreglo de dos amplificadores LOCK-INs para medir micromovimiento y la impedancia espectral simultáneamente. A partir del análisis de micromovimiento se obtuvo una dimensión fractal de D = 1.94(3) para el estado celular confluente. Este valor se estimo utilizando el algoritmo de Higuchi, previamente validado con la función de Weirstrass

Ulacco, Iago Nicolás

RID-UNRN (Universidad Nacional de Río Negro)

Caracterización de células MDCK-II mediante técnicaECIS e implementación de un arreglo experimental dedos amplificadores LOCK INs para medirmicromovimiento.Ulacco, Iago Nicolás1.1iago.ulacco@ib.edu.arInstituto Balseiro. Argentina.5 de junio del 2025ResumenSe caracterizó la linea celular MDCK-II mediante la técnica ECIS. Se observóla evolución de cultivos ante ensayos de herida eléctrica y cicatrización. Se observóuna reducción en la impedancia del sistema, correspondiente a muerte celular y elposterior aumento por cicatrización del tejido. También se implementó un arreglode dos amplificadores LOCK-INs para medir micromovimiento y la impedancia es-pectral simultáneamente. A partir del análisis de micromovimiento se obtuvo unadimensión fractal de D = 1.94(3) para el estado celular confluente. Este valor seestimo utilizando el algoritmo de Higuchi, previamente validado con la función deWeirstrass.1 IntroducciónLa técnica detección de impedancia eléctrica célula-sustrato (Electrical Cell-ImpendanceSensing, ECIS) es un método no invasivo que permite medir la impedancia espectraleléctrica de un cultivo celular monocapa entre dos electrodos. El cultivo celular se an-tepone al paso de corriente, y esta puede circular por dos caminos; atravesando la celulapor la membrana plasmática o a través de uniones intercelulares, véase figura 1. La capacelular se modela como un circuito RC en paralelo, ya que la corriente puede circularpor ambos caminos simultáneamente. Las uniones intercelulares se modelan mayormentecomo resistores, y la membrana celular como un capacitor. Al excitar el sistema concorriente alterna, a bajas frecuencias la reactancia capacitiva será dominante, y por endela corriente fluirá predominantemente por las uniones intercelulares. Esto resulta en unaimpedancia monitoreada mayormente resistiva. Análogamente, para frecuencias altasserá predominantemente capacitivo. Es por esto que es necesario medir en un rango defrecuencias de excitación.1Figura 1: Ilustración de las ĺıneas de corrientes en un sistema de detección de impedanciacélula-sustrato. Las uniones intercelulares son predominantemente resistivas y la célula,capacitiva.Adicionalmente, se ha observado que la evolución temporal de la impedancia del sis-tema presenta fluctuaciones alrededor de un valor medio, debido a pequeños cambios enlas ĺıneas de corriente. Estos se denominan micromovimiento celular y se ha visto quetienen un comportamiento fractal [1]. Se entiende por fractal a una estructura geométricaque es similar a diferentes escalas. El tamaño del fractal transforma con una potencia delcambio de escala, que se entiende como la dimensión fractal, que no necesariamente coin-cide con su dimensión geométrica. En otros estudios se vio que dicho parámetro proveeinformación del estado biológico de la muestra [2].En este trabajo se caracterizó la ĺınea celular MDCK-II (células epiteliales de riñonde cócker hembra sana) mediante la técnica ECIS. Se observó su comportamiento en unensayo de herida y cicatrización por corriente invasiva desde el estado confluente. Tambiénse modificó un sistema tradicional de medición ECIS para poder medir simultáneamentemicromovimiento y la impedancia espectral. De esta forma se puede acceder a mayorcantidad de información en un mismo experimento, cosa que no es posible con el arregloestádar del laboratorio. Por otro lado, se analizó la estructura de las fluctuaciones con elalgoritmo de Higuchi para determinar la dimensión fractal asociada a un estado confluente.2 MetodoloǵıaLas células se colocan en wells de cultivo con dos electrodos circulares impresos en labase, véase figura 2b. La estructura es una placa multiwell que permite la conexiónde varios cultivos al circuito de medición. La misma se coloca en una incubadora queasegura condiciones controladas de 37oC y con 5% de CO2 durante la medición. Estaconfiguración favorece la reproducción y crecimiento de células mamı́feras [3].En la figura 2a se observa un esquema del arreglo experimental utilizado. La placamultiwell se conecta a través de un selector de canales (multiplexor) a una fuente deseñal que env́ıa una sinusoidal con una amplitud de corriente no invasiva (< 1 µA).2Figura 2: (Derecha) Esquema del arreglo experimental tradicional. (Izquierda) well com-ercial de Applied Biophysics.En simultáneo un amplificador Lock-In (LIA) conectado en paralelo mide la tensión.Utilizando una computadora, se seleccionan las frecuencias de excitación (9 frecuenciasgeométricamente espaciadas entre 250 Hz y 64 kHz), se registran los datos, y la mismacomanda el multiplexor para cambiar al siguiente electrodo. Luego de medir todos loselectrodos de interés, se repite el ciclo continuamente. Este protocolo permite monitorearla respuesta de varios cultivos de forma ininterrumpida.Para llegar a la instancia de experimentación se utiliza el estado de cultivo de mayorimpedancia, en el que este cubre toda la superficie del well. La formación del cultivocomienza con la medición del well sin células, seguidamente, se depositan células disoci-adas en la superficie del sustrato (y el electrodo). Estas se duplican hasta ocupar toda elárea disponible formando una monocapa y cubriendo los caminos de corriente. El tipo decélulas estudiadas presentan inhibición por contacto, lo que significa que no se reproducensi se encuentran rodeadas de vecinos. En consecuencia, al cubrir toda el área del well,el cultivo alcanza un estado estacionario, que se denomina confluente, y se refleja en elcomportamiento de la señal de impedancia.El arreglo descripto en la figura 2a no puede medir micromovimiento y el espectrosimultáneamente, ya que solo excita y mide con una única frecuencia. Es por ello quese diseño e implementó un cambio en el arreglo experimental para medir con un LIAmicromovimiento, y con un segundo LIA, el espectro de impedancia eléctrica. Para esto,también se adaptó su software de adquisición de datos (en Visual Basic 2022). La fre-cuencia seleccionada fue 5927 Hz, que corresponde a un número primo que está cerca delcentro geométrico del espectro medido. En la figura 3 se observa el esquema de la nuevaconfiguración.Figura 3: Esquema del arreglo experimental implementado con dos Lock-Ins y el chipsumador, que permite medir micromovimiento y el espectro simultáneamente.33 Resultados y discusiónEn la figura 4 se muestra la evolución temporal de la impedancia durante la formación dela monocapa. Se ve que aumenta, lo cual es consistente con el modelo del cultivo comouna impedancia en serie al electrodo. Las fases medidas fueron negativas, por lo que esposible analizar al circuito como un RC equivalente.Figura 4: Resistencia y capacitancia del cultivo antes y después del deposito de las células.Evolucionan hasta alcanzar confluencia.La evolución en el tiempo durante el proceso de siembra del espectro se aprecia enla figura 5. Consistente con el modelo, a bajas frecuencias la resistencia es mayor quela reactancia capacitancitiva (que va con el inverso del producto de la capacitancia y lafrecuencia).Figura 5: Resistencia y capacitancia del cultivo antes y después del deposito de las célulaspara cada frecuencia. Se aprecia que la resistencia es mayor a bajas frecuencias.Por otro lado, en la figura 6 se observa el efecto del sometimiento del cultivo a unacorriente invasiva, de 1.9 mA a 40.000 Hz por ′45. La corriente es suficiente para haceraberturas en la membrana plasmática y no dar tiempo a repararla, resultando en muerte4celular. La reducción de la impedancia a niveles del electrodo sin célula, es consistentecon la muerte de las mismas sobre el electrodo. Las células fuera de este, al no tenermás inhibición por contacto comienzan a dividirse para cubrir la herida. Al cicatrizar laimpedancia recupera valores cercanos a la confluencia mantenida por el cultivo control(que no fue electrocutado).Figura 6: Evolución de tres ensayos de herida y cicatrización sobre un cultivo confluente.La discontinuidad (ĺıneas punteadas) es porque se desconecta el circuito para electrocutar.Es posible verificar visualmente lo ocurrido durante el ensayo con microfotograf́ıa. Eneste caso se usó el microscopio óptico Nikkon Eclipse T2. La figura 7 corresponde alensayo de herida. En la de la derecha se ve una formación más oscura y rugosa sobre elelectrodo, que se debe a células muertas por la electrocución.Figura 7: Imágenes por microscoṕıa de un cultivo antes (izquierda) y después (derecha) dela herida eléctrica. La formación rugosa y más oscura en esta última son células muertasque quedan por encima de la capa celular.Luego de caracterizar la respuesta electrica de la ĺınea MDCK II en el proceso de for-mación del cultivo, y en un ensayo de herida y cicatrización utilizando el esquema exper-imental estandar, se implementó el sistema de dos LIAs para adicionalmente monitorearmicromovimiento de forma simultanea. Este nuevo esquema fue testeado comparandolo5la medicion de distintos cultivos e impedancias pasivas con el sistema estandar. En lafigura 8 se aprecian los valores de impedancia medidos del sistema nuevo (Rn o Cn) nor-malizados con los del sistema estandar (Rs o Cs). De esta forma se denota la discrepanciaen los valores medidos por ambos sistemas ante la misma impedancia medida. Se ve quela diferencia es dependiente de la frecuencia.Figura 8: Impedancia relativa entre los espectros de los arreglos estándar (s) y el nuevo(n).El objetivo de este arreglo era medir micromovimiento simultáneamente al espectro,en este caso se probó con la frecuencia de 5927 Hz. En la figura 9 se ve la evolución de laimpedancia. El valor medido es consistente con el espectro medido con el nuevo sistema.Figura 9: Fluctuaciones en el tiempo de la impedancia de un cultivo a 5927 Hz.Para analizar estas fluctaciones como estructura fractal se aplicó el método de Higuchi.Este consta de tomar r sucesiones de la forma ym(m+Mr) ∈ y(t) (la señal) para un ciertom ∈ T (conjunto de todos los puntos) y hacer el promedio entre elementos sucesivos dela misma, que es Lr. Si Lr ∝ r−D entonces se dice que D es la dimensión fractal. Elalgoritmo fue implementado en python y testeado con la función de Weirstrass. Estapresenta una estructura fractal conocida y manipulable. Se observó que la estimación dedimensión fractal se hace correctamente para una señal de al menos 10500 puntos. Espor esto que para realizar una estimación estad́ıstica de la dimensión fractal del cultivose segmentó de dicha longitud. Seguidamente, para cada segmento se estimo la dimensónfractal, obteniendo un valor promedio con su dispersión. Como observamos en la figura 86la medición del equipo nuevo no es compatible con la de referencia. No obstante, como ladiferencia se debe a un corrimiento del valor y la estructura fractal corresponde a fluctua-ciones en su entorno, se conjetura que la dimensión fractal sea la misma. En la figura 10se observan los ajustes realizados para obtener la dimensión para el micromovimiento dela resistencia en 1 electrodo, en cada uno de los segmentos de 10500 puntos. Considerandosu promedio, se estima una dimensión fractal de 1.94(3) excitando a 5927 Hz. Se obtienenresultados idénticos para la capacitancia.Figura 10: Estimaciones de la dimensión fractal del micromovimiento utilizando el algo-ritmo de Higuchi.4 ConclusionesSe estudió la ĺınea celular tipo MDCK II mediante la técnica de detección de impedanciacélula-sustrato. Se determinó su impedancia y observó su comportamiento durante elcrecimiento celular, y luego de un ensayo de herida y cicatrización. El aumento de lamisma es consistente con su modelado como circuito RC en paralelo, y el estacionarioalcanzado es un indicio de confluencia. La herida se evidenció como una disminuciónde la impedancia, lo cual se pudo verificar visualmente mediante microscoṕıa optica. Laevolución a valores de impedancia previos a la herida se interpreta como una cicatrización.Por otro lado, se implementó un arreglo experimental para medir simultáneamente elespectro y el micromovimiento, usando dos amplificadores Lock-In, dos fuentes y un chipsumador. Se compararon las mediciones entre ambas configuraciones experimentales. Seencontró una discrepancia dependiente en frecuencia de excitación. También se estudiólas fluctuaciones de la impedancia en el tiempo, que estudios previos reportaban con uncomportamiento fractal; se logró identificar una dimensión fractal mediante el empleodel algoritmo de Higuchi. A futuro queda corroborar que la estructura identificada nocambié entre los arreglos. Esto se conjetura porque el cambio observado corresponde acorrimiento y en śı misma la estructura de la impedancia debeŕıa ser única. También sesugiere hacer mediciones apagando una de las fuentes alternadamente, para identificarfrecuencias filtradas que se observan como picos en la impedancia.7Bibliograf́ıa[1] Ivar Giaever and Charles R Keese. Micromotion of mammalian cells measured elec-trically. Proceedings of the National Academy of Sciences, 88(17):7896–7900, 1991.[2] Esteban Acerbo. Mediciones de impedancia eléctrica espectral en células y desarrollode un arreglo dual de amplificadores Lock-In. Tesis de maestŕıa en ciencias f́ısicas,Instituto Balseiro, 2022.[3] R Ian Freshney. Culture of animal cells: a manual of basic technique and specializedapplications. John Wiley & Sons, 2015.8

Caracterización de células MDCK-II mediante técnica ECIS e implementación de un arreglo experimental de dos amplificadores Lock-Ins para medir micromovimiento

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