Characterization of recombinant IgA producing CHO cells and product purification

Abstract

Obwohl heutzutage mehrere Techniken zur Verfügung stehen, bleibt die Entwicklung gut produzierender rekombinanter Zelllinien schwierig. Die beiden IgA produzierenden Zelllinien 3D6-IgA/5C5 und 4B3-IgA/6H2, deren Produkte gegen das Hüllprotein gp41 des Humanen Immundefizienz-Virus 1 (HIV-1) gerichtet sind, wurden zuvor entwickelt und zeigten sehr unterschiedliche spezifische Produktionsraten. In der vorgelegten Arbeit wurden die Genkopienzahlen der schweren und leichte Ketten sowie der sogenannten Joining-Chain in beiden Produktionsklonen analysiert und auch die intrazellulären Mengen an Transkripten verglichen. Die Methode der Wahl für diesen Zweck war quantitative Real-time PCR, die für die isolierte genomische DNA und cDNA angewendet wurde. In verschiedenen Vorversuchen wurde die Methode optimiert und anschließend mehrere unabhängige Proben in der Real-time PCR analysiert und verglichen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigten Unterschiede zwischen den Gen-Kopienzahlen und auch zwischen der Menge an Transkripten, allerdings konnte keine eindeutige Korrelation zwischen der Anzahl der Genkopien und der Transkriptionsrate sowie zwischen der Transkriptionsrate und den verschiedenen spezifischen Produktivitäten identifiziert werden. Die Ergebnisse legen nahe, dass in diesem Fall Gen-Kopien und Transkriptmengen keinen signifikanten Einfluss auf die Produktivität haben, aber Engpässe in anderen Teilen der Proteinexpressions-Maschinerie die Antikörper-Synthese beeinflussen. Neben der Bedeutung der Entwicklung gut produzierender Zelllinien für biotechnologische Prozesse besteht auch die Notwendigkeit funktionelle Methoden zur Reinigung der Produkte zu erarbeiten, die zu hoher Reinheit und akzeptablen Wiederfindungsraten führen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden IgA Aufreinigungen mit Hilfe einer IgA Affinitätsmatrix erfolgreich durchgeführt.Although many techniques are available, the establishment of well-producing recombinant cell lines remains difficult. The two recombinant cell lines 3D6-IgA/5C5 and 4B3-IgA/6H2, that produce IgAs which are both directed against the gp41 envelope protein of the human immunodeficiency virus 1 (HIV-1), were previously generated and resulted in significantly different specific productivities. In this work, we compared the two cell lines according to their IgA heavy chain, light chain and joining chain gene copy numbers as well as the intracellular amount of transcripts. The method of choice for this purpose was quantitative real-time PCR and was performed using genomic DNA and cDNA. Method optimization was conducted and several quantification approaches of real-time PCR were analysed and compared. The obtained results showed differences among the gene copy numbers and also the amount of transcripts. However, no significant correlation between the number of product related gene copies and their transcription rates as well as between the transcription rates and the different specific productivities could be identified. The results suggested that gene copy and transcript numbers are not the only parameters influencing productivities, but bottlenecks elsewhere in the protein expression machinery may control antibody synthesis and secretion. In the second part of this work antibody purification using an IgA affinity matrix was successfully performed with camelid affinity ligands yielding highly pure IgAs with rather good recovery. This down-stream procedure enables IgA purification with high purity and acceptable recovery rates.submitted by Sommeregger WolfgangZsfassung in dt. SpracheWien, Univ. für Bodenkultur, Masterarb., 2012(VLID)103612