Conservação de tecido somático de peixe-boi marinho, Trichechus Manatus Manatus (Linnaeus, 1758) usando diferentes técnicas e soluções de criopreservação

Abstract

Os criobancos de tecidos somáticos são importantes ferramentas para a conservação e conhecimento das espécies, especialmente aquelas ameaçadas de extinção como o peixe-boi marinho, que vem tendo sua população reduzida por ações antrópicas. Assim, faz-se necessário a otimização de protocolos para redução de danos ocasionados pelas técnicas de criopreservação. Diante deste cenário, o presente trabalho teve como objetivos avaliar o potencial da criopreservação para tecidos somáticos de peixe-boi marinho (Etapa 1), bem como aperfeiçoar o protocolo de vitrificação (Etapa 2). Para tanto, foram coletados fragmentos oriundos da pele de seis peixes-boi marinho mantidos no Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Mamíferos Aquáticos, na Ilha de Itamaracá, Pernambuco, e divididos em duas etapas. Na primeira etapa, fragmentos foram distribuídos nos grupos congelação lenta (CL) e vitrificação em superfície sólida (VSS). Já na segunda etapa, fragmentos foram alocados nos grupos vitrificados com diferentes soluções: 3M-EG+3MDMSO, 1,5M-EG+1,5M-DMSO, 3M-EG e 3M-DMSO. Tecidos não criopreservados foram utilizados como grupo controle nas duas etapas. Para todos os experimentos, fragmentos foram avaliados quanto à ultraestrutura, espessura da derme, quantificação de fibroblastos, percentual de fibras colágenas e potencial proliferativo tecidual. Além disso, células resultantes dos explantes cultivados foram avaliadas quanto à morfologia, aderência, viabilidade, atividade proliferativa, atividade metabólica, níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs), potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) e níveis de apoptose. Na primeira etapa, a VSS não alterou a espessura da derme (P > 0,05), mas, ambas as técnicas diminuíram a quantidade de fibroblastos e aumentaram o percentual de fibras colágenas (P < 0,05). A CL manteve o potencial proliferativo tecidual, semelhante aos tecidos não criopreservados. No cultivo in vitro, apenas fragmentos do grupo VSS não apresentaram crescimento celular no período de 60 dias. Para o grupo CL, células obtidas não apresentaram redução na sua viabilidade e atividade proliferativa (P > 0,05), entretanto, houve redução no metabolismo e aumento dos níveis de apoptose, EROs e ΔΨm em comparação com células de tecidos não criopreservados. Já na segunda etapa, não houve diferença na ultraestrutura, sendo observado aumento na espessura da derme no grupo 1,5M-EG+1,5M-DMSO. Em todos os grupos vitrificados houve redução nos fibroblastos e aumento da matriz colágena (P < 0,05). Contudo, a vitrificação com 3,0M-EG+3,0M-DMSO manteve o potencial proliferativo dos tecidos. Nenhum dos fragmentos vitrificados foram capazes de produzir células em cultivo in vitro. Em conclusão, tecidos somáticos de peixe-boi marinho podem ser criopreservados por congelação lenta, produzindo células viáveis após cultivo in vitro. Os tecidos quando vitrificados, mesmo com redução na concentração, bem como a associação dos crioprotetores intracelulares não permitiram a obtenção de células, o que evidencia necessidade do aperfeiçoamento de protocolos, visando aumentar a qualidade dos bancos de tecidos somáticos nesta espécieSomatic tissue cryobanks are important tools for the conservation and knowledge of species, especially those threatened with extinction such as the Antillean manatee, whose population has been reduced by human actions. Thus, it is necessary to optimize protocols to reduce damage caused by cryopreservation techniques. Given this scenario, the present study aimed to evaluate the potential of cryopreservation for somatic tissues of marine manatee (Step 1), as well as to improve the vitrification protocol (Step 2). For this, fragments from the skin of six Antillean manatees kept at the National Center for Research and Conservation of Aquatic Mammals, on the island of Itamaracá, Pernambuco, were collected and divided into two stages. In the first step, fragments were distributed in the slow freezing (SF) and solid surface vitrification (SSV) groups. In the second step, fragments were allocated to groups vitrified with different solutions: 3M-EG+3M-DMSO, 1.5M-EG+1.5M-DMSO, 3M-EG and 3M-DMSO. Non-cryopreserved tissues were used as a control group in both stages. For all experiments, fragments were evaluated for ultrastructure, thickness of the dermis, quantification of fibroblasts, percentage of collagen fibers and tissue proliferative potential. In addition, cells resulting from cultured explants were evaluated for morphology, adherence, viability, proliferative activity, metabolic activity, levels of reactive oxygen species (ROS), mitochondrial membrane potential (ΔΨm) and levels of apoptosis. In the first step, SSV did not change the thickness of the dermis (P > 0.05), but both techniques reduced the number of fibroblasts and increased the percentage of collagen fibers (P < 0.05). SF maintained tissue proliferative potential, similar to non-cryopreserved tissues. In the in vitro culture, only fragments of the SSV group did not show cell growth in the period of 60 days. For the SF group, cells obtained showed no reduction in their viability and proliferative activity (P > 0.05), however, there was a reduction in metabolism and increased levels of apoptosis, ROS and ΔΨm compared to cells from non-cryopreserved tissues. In the second stage, there was no difference in the ultrastructure, with an increase in the thickness of the dermis being observed in the 1.5M-EG+1.5M-DMSO group. In all vitrified groups there was a reduction in fibroblasts and an increase in collagen matrix (P < 0.05). However, vitrification with 3.0MEG+3.0M-DMSO maintained tissue proliferative potential. None of the vitrified fragments were able to produce cells in in vitro culture. In conclusion, Antillean manatee somatic tissues can be cryopreserved by slow freezing, producing viable cells after in vitro culture. The tissues when vitrified, even with a reduction in concentration, as well as the association of intracellular cryoprotectants did not allow obtaining cells, which shows the need to improve protocols, aiming to increase the quality of somatic tissue banks in this species113 p.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes