Investigating the molecular mode of action of new series of antituberculosis compounds and the role of the Tap efflux pump in persistence and drug tolerance in mycobacteria

Abstract

La tuberculosis sigue siendo hoy en día una de las enfermedades infecciosas más mortales a nivel mundial. Por ello, es necesario desarrollar nuevos fármacos con mecanismos de acción novedosos que sean eficaces frente a cepas multirresistentes de Mycobacterium tuberculosis (Mtb), así como acortar la duración de los tratamientos actuales. Estos nuevos agentes antimicrobianos pueden proceder de programas de descubrimiento de nuevos fármacos (de novo) o bien del reposicionamiento de fármacos, como se describe en los Capítulos 1 y 2 de esta tesis, respectivamente. En el Capítulo 1, se caracteriza la actividad de una nueva serie química de compuestos obtenidos mediante un programa de medicina química frente a diversas bacterias, tanto in vitro como ex vivo. Posteriormente, se utilizan diferentes aproximaciones para elucidar el mecanismo de acción molecular de estos compuestos: (i) ensayos estándar de selección de mutantes resistentes realizados con la cepa silvestre de Mtb en presencia de concentraciones inhibitorias del compuesto; (ii) cribado de una banca de mutantes por transposición en Mycobacterium bovis BCG para identificar mutantes resistentes o susceptibles a los compuestos. Si bien no se identificaron mutantes resistentes, se seleccionaron varios mutantes susceptibles, cuyo fenotipo de susceptibilidad aumentada se validó mediante ensayos de determinación de la CIM, pruebas de susceptibilidad en placas de agar, y cinéticas de muerte. Encontramos que tres mutantes susceptibles a los compuestos de estudio tienen el transposón insertado en un gen que codifica para una proteína transmembrana implicada en la adquisición de hierro, lo que sugiere que el mecanismo de acción de estos compuestos está relacionado con el metabolismo del hierro. En un cribado de sinergias realizado frente a Mtb, los compuestos de estudio mostraron sinergia con varios fármacos utilizados para el tratamiento de la tuberculosis, lo que sugiere que estos compuestos podrían emplearse en terapia combinada frente a Mtb. Además, tras tratar Mtb con estos compuestos, se detectó una alteración en los niveles de ATP y en el consumo de O2, por lo que estos resultados sugieren que estos compuestos podrían interferir con el metabolismo energético. Finalmente, el análisis transcriptómico realizado indica que estos compuestos afectan tanto al metabolismo del hierro como al metabolismo energético, respaldando los resultados obtenidos previamente. En el Capítulo 2, se utiliza un modelo de granuloma in vitro 3D para estudiar la actividad antimicrobiana de una familia de compuestos químicos utilizados para el tratamiento de diversos trastornos psiquiátricos y con actividad demostrada frente a Mtb tanto in vitro como ex vivo. Estos compuestos redujeron la viabilidad bacteriana en el modelo de granuloma, indicando que estos compuestos son capaces de penetrar en los granulomas y mostrar actividad frente a micobacterias en estado latente. Puesto que estudios previos han demostrado que estos compuestos actúan inhibiendo Tap, una bomba de eflujo asociada con tolerancia a fármacos, en el Capítulo 2 se explora más a fondo el papel de la bomba de eflujo Tap en micobacterias utilizando el modelo de granuloma y estudios de RNA-seq. En el modelo de granuloma, el mutante de Mtb defectivo en la bomba de eflujo Tap mostró una tasa de replicación ligeramente más baja que la cepa salvaje y desarrolló una menor proporción de bacterias tolerantes a RIF que la cepa salvaje. A través de los estudios de RNA-seq, se detectó un mayor número de genes diferencialmente expresados en fase exponencial en comparación con los detectados en fase estacionaria, lo que sugiere que Tap podría ser más relevante para Mtb en estado replicativo. Además, los resultados obtenidos sugieren que la ausencia de Tap podría alterar la composición de la pared celular y, en consecuencia, comprometer la virulencia de Mtb, provocando que la bacteria sea más susceptible a diversos fármacos, principalmente a aquellos dirigidos a la pared celular. Tuberculosis remains one of the deadliest infectious diseases worldwide. Therefore, there is an urgent need to develop new drugs with novel modes of action effective against multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis (Mtb) strains and to shorten the duration of current anti-tuberculosis therapies. Potential new drugs can come from both de novo drug discovery and drug repurposing approaches, as shown in Chapters 1 and 2 of this thesis, respectively. In Chapter 1, the antimicrobial activity of a new chemical series coming from a medicinal chemistry program was characterized against diverse bacteria in vitro and ex vivo. Then, different approaches were used to elucidate the molecular mode of action of these compounds: (i) standard mutant isolation assays at inhibitory concentrations using Mtb wild type; (ii) screening of a Mycobacterium bovis BCG transposition library to identify either resistant or susceptible mutants. While resistant mutants were not identified, several susceptible mutants were selected and their drug-sensitive phenotype validated by MIC determination, susceptibility testing on agar plates and time kill assays. Interestingly, three susceptible mutants had the transposon inserted in a gene encoding a transmembrane transport protein related to iron acquisition, suggesting that the MoA of these compounds is related to iron metabolism. In a synergy screening performed against Mtb, these compounds displayed synergism with several anti-TB drugs, indicating a potential role in combination therapy against Mtb. Moreover, treatment of Mtb with these compounds altered ATP production and O2 consumption, suggesting that this new chemical series might interfere with energy metabolism. Transcriptomic studies further supported that these compounds affect both iron metabolism and the oxidative phosphorylation. In Chapter 2, an in vitro 3D granuloma model was used to study the antimycobacterial activity of a chemical family of compounds used to treat several psychiatric disorders and shown to be active against Mtb in vitro and ex vivo. These compounds reduced bacterial viability in the granuloma model, indicating that they are able to penetrate into the granulomas and display activity against dormant mycobacteria. Taking into consideration the previous association of the Tap efflux pump with drug tolerance and the potential Tap inhibitory activity of these compounds, the role of Tap in mycobacteria was further explored by using the granuloma model and RNA-seq studies. In the granuloma model, the Mtb mutant with the tap gene disrupted displayed a slight lower replication rate than the wild type strain and developed RIF-tolerant bacteria at a lower rate than the respective parental strain. RNA seq studies showed that Tap disruption triggers more transcriptional changes in actively replicating bacteria than in non replicating bacteria, thus suggesting that Tap could be more relevant for replicating bacteria. Moreover, the results obtained by RNA-seq suggested that the absence of Tap in Mtb might result in an altered cell wall composition that may compromise its cell wall associated virulence and render the bacterium more vulnerable to diverse drugs, but mainly cell wall targeting drugs.<br /