Análisis funcional y estructural de las proteínas que componen el viroplasma del Virus del Mal de Río Cuarto. Desarrollo de estrategias biotecnológicas para el diagnóstico y control de la enfermedad

Abstract

Mal de Río Cuarto virus (MRCV) is a member of the Fijivirus genus of the Reoviridae family that causes the most important maize viral disease in Argentina and is persistently and propagatively transmitted by planthopper vectors. The viral genome consists of 10 segments of dsRNA. In plants, disease symptoms are dwarfism, shortening of internodes, partial sterility and the formation of tumors of phloem tissue in the abaxial veins of the leaves, called enations. Infected plants in late stages of development do not show symptoms. Early in the infection cycle, viral proteins P6 and P9-1 and host proteins form viroplasms. Viroplasms are granular cytoplasmic macrostructures with an electron-dense appearance, which function as viral factories where genomic replication and the assembly of new viral particles occur. P6 and P9-1 interact with themselves and with each other, and P9-1 binds RNA and exhibits ATPase activity. In order to deepen into the structural and functional study of P9-1, the influence of the 24 C-terminal residues (C-arm) of the protein on its ability to multimerize and its functional activities were evaluated. Analysis of the expression of P9-1 and a deletion mutant lacking the C-arm (P9-1?C-arm) fused to GFP in insect and plant cells allowed us to conclude that the presence of the C-arm is necessary for the formation of viroplasm-like structures in vivo. On the other hand, interaction analysis of P9-1 and P9-1?C-arm with nucleic acids indicated that P9-1 has a high affinity for long-chain nucleic acids while P9-1?C-arm has more affinity for short chain nucleic acids. These results allowed us to conclude that the binding capacity to nucleic acids is modulated by protein multimerization. Likewise, the cloning, recombinant expression and purification of P9-1 and P9-1?C-arm carried out in this Thesis allowed the subsequent structural characterization of both proteins by collaborating groups who determined that P9-1 forms decamers and dodecamers in solution while P9-1?C-arm forms dimers. Next, the presence of intrinsically disordered regions (IDRs) in P9-1 was predicted, identifying two IDRs located in the N-terminal region and in the central region. These results partially coincided with what was observed in the crystallographic structure of the protein, where these zones correspond to highly flexible loops. The location of the ATPase site of P9-1 was also predicted using three different methodologies that indicated that the ATP-binding region would be located at the interface between monomers. On the other hand, tools were developed to assist in the study of the viroplasm and the diagnosis of the disease. In particular, a) a library of nanobodies (Nbs)\nobtained from the immunization of a llama with two P6 mutants was biopanned. After performing a phage ELISA, three Nbs directed against P6 were selected and, in a preliminary analysis by Y2H, it was determined that all of them bind to the C-terminal region of the protein; b) the detection of P9-1 and P9-1?C-arm by three selected Nbs (Nb1, Nb13 and Nb25) was characterized by direct ELISA and western blot. It was determined that Nb1 binds to an epitope that is unaffected by the C- arm deletion, Nb13 could target an epitope present in the C-arm or in the final conformation of the entire protein while Nb25 recognizes P9-1 under native conditions and only binds to the reduced and denatured form of P9-1?C-arm. These results indicate that the three characterized Nb are able to recognize different epitopes and versions of P9-1; c) Nbs fusions to fluorescent proteins were engineered and they detected P9-1 in the phloem of infected leaves by confocal microscopy. Fusions of these same Nbs to alkaline phosphatase (AP) were also obtained; d) using the Nb:eGFP and Nb:AP fusions, a sandwich ELISA was developed which showed high diagnostic sensitivity (99.12 %, 95 % CI 95.21 ? 99.98) and specificity (100 %, 95 % CI 96.31 ? 100) and a detection limit of 0.236 ng/mL. In addition, this ELISA was useful for detecting the presence of the virus in insect vectors. Taken together, the results obtained here contribute to the understanding of the molecular mechanisms underlying viroplasm formation and lead to the hypothesis that P9-1 multimerization and the binding of said multimers to viral RNA triggers the liquid-liquid phase separation process giving rise to the formation of early viroplasmas and that this process relies on the presence of the C-arm. The Nbs generated in this Thesis will assist in the study of the MRCV epidemiology, help maize breeding programs, be valuable tools to promote fundamental research on the composition, structure and maturation of the viroplasm and be useful in the development of antiviral strategies.Fil: Monti, Demián Esteban. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, ArgentinaEl virus Mal de Río Cuarto (MRCV) es un miembro del género Fijivirus de la familia Reoviridae que causa la enfermedad viral más importante del maíz en Argentina y es transmitido de forma persistente y propagativa por chicharritas vectoras. El genoma viral consiste de 10 segmentos de ARNdc. En plantas, los síntomas de la enfermedad son enanismo, acortamiento de entrenudos, esterilidad parcial y la generación de tumores de tejido floemático en las nervaduras abaxiales de las hojas, denominados enaciones. Las plantas infectadas en estadios tardíos de desarrollo no presentan síntomas. A tiempos tempranos de la infección, las proteínas virales P6 y P9-1 y proteínas del hospedante forman viroplasmas. Los viroplasmas son macroestructuras citoplasmáticas granulares de apariencia electrodensa, que funcionan como fábricas donde ocurre la replicación genómica y el ensamblado de nuevas partículas virales. P6 y P9-1 interactúan consigo mismas y entre sí y P9-1 une ARN y presenta actividad ATPasa. Con el objetivo de profundizar en el estudio estructural y funcional de P9-1, se evaluó la influencia de los 24 residuos C-terminales (C-arm) de la proteína sobre su capacidad de multimerizar y sus actividades funcionales. El análisis de la expresión de P9-1 y de la mutante de deleción que carece del C-arm (P9-1?C-arm) fusionadas a GFP en células de insecto y vegetales permitió concluir que la presencia del C-arm de P9-1 es necesaria para la formación de estructuras similares a viroplasma in vivo. Por otra parte, los análisis de la interacción de las proteínas P9-1 y P9-1?C-arm con ácidos nucleicos indicaron que P9-1 tiene una alta afinidad por ácidos nucleicos de cadena larga mientras que P9-1?C-arm es más afín por ácidos nucleicos de cadena corta. Estos resultados permitieron concluir que la capacidad de unión a ácidos nucleicos está modulada por la multimerización. Asimismo, el clonado, expresión recombinante y purificación de P9-1 y de P9-1?C-arm realizado en esta Tesis permitió la posterior caracterización estructural de ambas proteínas por parte de grupos colaboradores quienes determinaron que P9-1 forma decámeros y dodecámeros en solución mientras que P9-1?C-arm forma dímeros. A continuación, se predijo la presencia de regiones intrínsecamente desordenadas (IDRs) en P9-1, identificándose dos IDRs ubicadas en la región N-terminal y en la región central. Estos resultados coincidieron parcialmente con lo observado en la estructura cristalográfica de la proteína, donde estas zonas se corresponden con loops altamente flexibles. También se predijo\nla ubicación del sitio ATPasa de P9-1 utilizando tres metodologías diferentes que indicaron que la región de unión a ATP se ubicaría en la interfase entre monómeros. Por otro lado, se desarrollaron herramientas para asistir al estudio del viroplasma y al diagnóstico de la enfermedad. En particular, a) se biopaneó una biblioteca de nanoanticuerpos (Nbs) obtenida a partir de la inmunización de una llama con dos mutantes de P6. A partir de un ELISA de fagos se seleccionaron tres Nbs dirigidos contra P6 y, en un análisis preliminar hecho por doble híbrido (Y2H), se determinó que los tres nanoanticuerpos se unen a la región C-terminal de la proteína; b) se caracterizó la detección de P9-1 y P9-1?C-arm por parte de tres Nbs seleccionados (Nb1, Nb13 y Nb25) mediante ELISA directo y western blot. Se determinó que el Nb1 se une a un epítope que no se ve afectado por la eliminación del brazo C-terminal, Nb13 podría dirigirse a un epítope presente en el brazo C-terminal o en la conformación final de la proteína completa, mientras que Nb25 reconoce a P9-1 en condiciones nativas y solo se une a la forma reducida y desnaturalizada de P9-1 ?C-arm. Estos resultados indican que los tres Nb caracterizados son capaces de reconocer distintos epítopes y versiones de P9-1; c) se obtuvieron fusiones de los Nbs mencionados a proteínas fluorescentes que permitieron la detección de P9-1 en el floema de hojas infectadas por microscopía confocal. También se obtuvieron fusiones de estos mismos Nbs a fosfatasa alcalina (AP); d) utilizando las fusiones Nb:eGFP y Nb:AP se desarrolló un ELISA sándwich que mostró una alta sensibilidad (99,12 %, 95 % IC 95,21 ? 99,98) y especificidad (100 %, 95 % IC 96,31 ? 100) diagnósticas y un límite de detección de 0,236 ng/ml. Además, este ELISA fue útil en la detección de la presencia del virus en insectos vectores de la enfermedad. En conjunto, los resultados obtenidos contribuyen a avanzar en los mecanismos moleculares que subyacen a la formación de viroplasma y conducen a proponer la hipótesis de que la multimerización de P9-1 y la unión de dichos multímetros al ARN viral desencadena el proceso de separación de fase líquido-líquido lo que da lugar a la formación de los viroplasmas tempranos del MRCV y que este proceso depende de la presencia del C-arm. Los Nbs generados en este trabajo de Tesis asistirán al estudio de la epidemiología del MRCV, ayudarán a los programas de mejoramiento de maíz, serán herramientas valiosas para impulsar la investigación fundamental sobre la composición, estructura y la maduración del viroplasma y se utilizarán para el desarrollo de estrategias antivirales.Doctor de la Universidad de Buenos Aires en Ciencias Biológica