ATTILI, Annarita

CUTERI, Vincenzo

MERLETTI L.

PREZIUSO, Silvia

VALENTE C.

Italian

Archivio istituzionale della ricerca - Università di Camerino

 159IDENTIFICAZIONE DI STREPTOCOCCUS DYSGALACTIAE SUBSP. EQUISIMILIS IN TAMPONI NASALI EQUINI MEDIANTE PCR  IDENTIFICATION OF STREPTOCOCCUS DYSGALACTIAE SUBSP. EQUISIMILIS IN EQUINE NASAL SWABS BY PCR  Preziuso S, Attili AR, Merletti L2, Valente C1, Cuteri V  -  Dipartimento di Scienze Veterinarie, Università di Camerino, Matelica (MC); 1Dipartimento di Patologia Diagnostica e Clinica Veterinaria, Università di Perugia, Perugia; 2Dipartimento di Medicina Sperimentale e Scienze Biochimiche, Università di Perugia, Perugia  Parole chiave: Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis, horse, polymerase chain reaction  Key words: Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis, horse, polymerase chain reaction   SUMMARY – Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis, previously called S. equisimilis, are β-haemolytic bacteria belonging to the Lancefield group C. Their normal habitat in horses appears to be skin and mucosal surfaces, but isolations have been made from aborted placentas, abscessed lymph nodes and from cases of a strangle-like disease. In swine and humans it is responsible for septicaemia and other severe diseases. In order to contribute to the diagnosis of S. equisimilis infection in horse, a PCR protocol has been developed to detect the streptokinase precursor gene in equine S. equisimilis strains and in nasal swabs collected from horses with respiratory signs. The protocol appeared specific and more sensitive than bacteriology in detecting S. equisimilis in enrichment broth shortly incubated with nasal swabs.  INTRODUZIONE – Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis, prima classificato S. equisimilis, è un batterio β-emolitico appartenente al gruppo C di Lancefield. Studi tassonomici recenti hanno generato non poca confusione proponendo, da un lato (1), l’inserimento degli isolati umani e di quelli animali rispettivamente in due sottospecie distinte, equisimilis e dysgalactiae, e dall’altro (2) il mantenimento di entrambi i tipi di isolati nella stessa sottospecie equisimilis. Il ruolo patogenetico di S. equisimilis nel cavallo è poco chiaro, in quanto il batterio è presente su cute e mucose, ma è stato isolato anche da placente e feti abortiti, da ascessi linfonodali e dalle prime vie respiratorie di cavalli con sintomatologia riconducibile ad adenite (3, 4). Comunemente isolato dalle tonsille e dalle mucose del suino, esso è ritenuto responsabile di setticemia, artrite ed endocardite in questa specie (5). Anche nell’uomo le segnalazioni di setticemia, faringite, artrite ed endocardite sostenute da S. equisimilis sono numerose. Mentre l’isolamento del germe non presenta difficoltà, la tipizzazione effettuata mediante prove biochimiche può risultare poco attendibile per la estrema variabilità e le analogie esistenti tra le subspecie (2). L’applicazione di un protocollo di PCR-in situ ha permesso l’identificazione di S. equisimilis in tessuti umani inclusi in paraffina utilizzando primer specifici per il gene precursore della streptochinasi (6), un enzima che catalizza la conversione del plasminogeno in plasmina, e che rappresenta un importante fattore di virulenza. Tale enzima presenta sensibili differenze nella sequenza aminoacidica se prodotto da isolati umani, equini o suini (7). Scopo del lavoro è stato quello di sviluppare un protocollo di PCR idoneo per l’identificazione di S. equisimilis di origine equina, valutando inoltre l’applicazione diagnostica direttamente su tamponi nasali prelevati da cavalli con sintomatologia respiratoria.  MATERIALI E METODI – La metodica è stata messa a punto impiegando 11 ceppi di campo isolati da tamponi nasali di cavallo e tipizzati con ApiSystem 20 Strep (bioMérieux, France), un ceppo di referenza (ATCC n.10009) ed altri 2 ceppi beta-emolitici, S. equi subsp. zooepidemicus e S. equi subsp. equi (forniti da J. Alber e C. Lämmler, Justus-Liebig-Universität of Gieβen, Germany), che frequentemente si isolano in corso di forme respiratorie. Standardizzata la tecnica, essa è stata eseguita direttamente sul brodo di arricchimento (PBS pH 7,2 con siero fetale bovino 2% e amfotericina B 0,0005%) in cui i tamponi erano stati incubati per 6 ore a 37°C. Sono stati inoltre processati 25 brodi di arricchimento che erano risultati batteriologicamente negativi per S. equisimilis ma da cui erano stati isolati E. coli, S. aureus, Aerococcus viridans tipo I e tipo III, Streptococcus mitis e Streptococcus equi subsp. zooepidemicus.  160Il DNA è stato estratto da quattro colonie utilizzando 50 μl di 20mM Tris-HCl, 2mM EDTA pH 8.0 con 5U/μl di lisozima (Sigma, Italy) a 37°C per 60 min. La sospensione è stata trattata con proteinasi K 0,3 μg/μl (Eurobio, France) a 56°C per 60 min. e, dopo bollitura a 100°C per 10 min. e centrifugazione a 10000g per 10 min., il surnatante è stato raffreddato ed utilizzato in PCR. L’estrazione da terreno liquido è stata effettuata centrifugando 1 ml di brodo a 20000g e sottoponendo il pellet ai trattamenti sopra descritti ma in un volume totale di 25 μl. I primer utilizzati per l’identificazione di S. equisimilis (Eqsim-F 5’-TCA AAT CGG TTG GCA CAG AC-3’ e Eqsim-R 5’-CGT CCT TAG CAT AGA AGG ATT GG-3’) sono specifici per un tratto di 279pb (889-1168) del gene precursore della streptochinasi dell’isolato equino S. equisimilis 87-542-W (7) (GenBank AF104301). Per verificare l’assenza di inibitori della PCR, lo stesso campione di DNA è stato sottoposto ad amplificazione utilizzando la coppia di primer 27-F 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG -3’ e 338-R 5’-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3’, specifici per un frammento (311pb) del gene batterico “universale” 16S rRNA (8). La PCR è stata effettuata in un volume finale di 25 μl contenente 12,5 μl di Taq PCR mastermix (Qiagen, Germany), 10 pmol di ogni primer (Operon Biotechnologies, Germany) e circa 100-300 ng di DNA estratto. Quantità scalari di DNA ottenuto da colonie di S. equisimilis sono state processate con identico protocollo per valutare la sensibilità del metodo. La metodica di amplificazione utilizzata consisteva in: 3 min. a 94°C, 35 x [1 min. a 94°C, 1 min. a 57°C e 1 min. a 72°C], 10 min. a 72°C. Il risultato è stato valutato mediante elettroforesi di 15 μl di amplificato su gel di agarosio 2% con bromuro di etidio 0,5μg/ml.  RISULTATI – In tutti gli 11 campioni di DNA estratto da S. equisimilis e dai relativi brodi di arricchimento è stato ottenuto un amplificato della grandezza attesa, mentre i campioni estratti dalle altre specie batteriche sono risultati negativi. 3 dei 25 (12%) campioni di brodo risultati negativi per S. equisimilis all’esame colturale sono risultati positivi in PCR, dimostrando una maggiore sensibilità del metodo. In tutti i campioni analizzati è stata ottenuta l’amplificazione con i primer controllo 27-F e 338-R, confermando che nei campioni risultati negativi per S. equisimilis non erano presenti inibenti della PCR. In nessuna prova sono apparse bande di amplificazione aspecifiche imputabili, tra l’altro, alla cross-reazione con gli altri microrganismi presenti nei brodi di arricchimento, dimostrando la elevata specificità del metodo. La PCR, effettuata su quantità scalari di DNA, ha prodotto una banda di amplificazione evidente fino alla quantità di 5 ng.   DISCUSSIONE – I risultati ottenuti dimostrano che i primer Eqsim-F ed Eqsim-R ed il protocollo di amplificazione permettono di identificare S. equisimilis sia dalle colonie che dai brodi di arricchimento dei tamponi. Tale arricchimento ha lo scopo di favorire lo sviluppo del microrganismo da sottoporre ad estrazione del DNA, ed è particolarmente utile quando S. equisimilis è presente in quantità modesta. Ulteriori studi potrebbero permettere di valutare se il tratto del gene precursore della streptochinasi sia specifico esclusivamente per i ceppi di origine equina, come risulta dall’analisi comparativa delle sequenze presenti in GenBank. La possibilità di processare 1 ml di brodo ha contribuito ad aumentare la sensibilità del metodo rispetto all’esame batteriologico, e questo potrebbe spiegare la positività riscontrata mediante PCR in 3 campioni risultati negativi all’esame colturale. L’applicazione pratica di questo protocollo, rapido e affidabile, potrebbe consentire una più approfondita valutazione epidemiologica di S. equisimilis nella specie equina, contribuendo a chiarire l’eventuale ruolo di questo microrganismo nell’insorgenza di alcuni stati patologici.  BIBLIOGRAFIA – (1) Vandamme P et al (1996) Int J Syst Bacteriol 46, 774-81, (2) Vieira VV et al (1998) Int J Syst Bacteriol 48, 1231-43, (3) Timoney JF (2004) Vet Res, 35, 397-409, (4) Laus F et al (2005) Atti SISVet LIX, 303-4, (5) Kawata K et al (2003) Int J Syst Evol Microbiol 53, 1941-46, (6) Nakamura M et al (2001) Legal Med, 3, 127-33, (7) Caballero AR et al (1999) Infect Immun, 67, 6478-86, (8) Halbert ND et al (2005) Am J Vet Res, 66, 1380-5 

Identificazione di Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis in tamponi nasali equini mediante PCR.

https://pubblicazioni.unicam.it/bitstream/11581/114537/1/Sisvet_2006_Streptococcus_equisimilis.pdf

Identificazione di Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis in tamponi nasali equini mediante PCR.

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